מיזם חוס"ן בוטריוספריה: חקר הגורמים הפתוגנים המעורבים ופיתוח שיטות למניעת הנזק באבוקדו ונשירים

Transcript

1 דו"ח לשנה השנייה מיזם חוס"ן בוטריוספריה: חקר הגורמים הפתוגנים המעורבים ופיתוח שיטות למניעת הנזק באבוקדו ונשירים מוגש לוועדת ההיגוי של המיזם ע"י דני שטיינברג, סטנלי פרימן, דוד עזרא, עומר פרנקל וורד יריחימוביץ המחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר העשבים, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן אלי סימנסקי חברת נבטים, מושב כרמל מעין גולני חברת לוכסמבורג תעשיות בע"מ, תל-אביב במחקר שותפו האנשים הבאים: מכון וולקני: רן שולחני, מנחם בורנשטיין, מרסל מימון, מיכל הרשקוביץ, אורנה ליארזי, נטע אוקון-לוי, מיכל שרון, חופית קול מימון, אייל הלון, עדי פייגבוים. שרות ההדרכה והמקצוע: שאול בן יהודה, שמעון אנטמן, יעל גרינבלט אברון, סמדר אידלין הררי, מיקי נוי, אייל רבן, ערן הרכבי, הדר כהן. מועצת הצמחים: יונתן מעוז, משה ברוקנטל, רני בר-נס, אודי גפני. השרותים להגנה"צ: ראול קלינרמן, עדנה לוי. נוספים: סיגל פרץ, שמוליק עובדיה, מרים זילברשטיין. הממצאים בדו"ח זה הינם תוצאות ניסויים. הניסויים לא מהווים המלצות לחקלאים. חתימת החוקר הראשי: פברואר 2016 אדר א' תשע"ו 1

2 חברי וועדת ההיגוי של המיזם מועצת הצמחים: משה ברוקנטל )מנהל אירגוני של המיזם(, אודי גפני, רני בר-נס, יונתן שאולסקי; מועצת גפן יין: צחי דותן; שה"מ: יוסי גרינברג; שירותים להגנה"צ: עדנה לוי; מו"פ צפון: אלקנה בן ישר; מכון וולקני: דני שטיינברג. חברי הוועדה המקצועית של המיזם מינהל המחקר החקלאי: דני שטיינברג )מרכז הוועדה המקצועית של המיזם(, סטנלי פרימן, דוד עזרא, עומר פרנקל, משה פליישמן, אתי אור; מו"פ צפון: דורון שניידר, אדולפו לוין, מרי דפני ילין; שרות ההדרכה והמקצוע: שמוליק גרוס, שאול בן יהודה, מיקי נוי, שמעון אנטמן, ערן הרכבי; השירותים להגנת הצומח: ראול קלינרמן; מועצת הצמחים: איציק דהאן; אנשי הדרכה בהגנת הצומח: אלי סימנסקי, סיגל פרץ, שמוליק עובדיה. שתלנים: ברכה אור, זוהר חנני, אבישי חסקלברג, אלי חייט. אנו שמחים לציין שעוזרי המחקר של המחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר העשבים השותפים במיזם זכו בתואר "צוות מצטיין" לשנת 2014 בתחרות העובדים והצוותים המצטיינים של משרד החקלאות ופיתוח הכפר. הצוות נבחר לעלות לתחרות בשלב הבין-משרדי. הנימוקים לזכייה מופיעים בנספח מס' 4. תוכן העניינים עמוד תקציר מנהלים פרק 1: התמודדות עם מחלת הבוטריוספריה באבוקדו דני שטיינברג, סטנלי פרימן, רן שולחני, מנחם בורנשטיין, אלי סימנסקי, מעין גולני, יונתן מעוז פרק 2: בחינה )ברמת הצמח השלם( של יחסי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי סטנלי פרימן ומרסל מימון פרק 3: חקר מנגנון השראת עמידות באבוקדו באמצעות ריסוס של החומר קנון ורד יריחימוביץ, אייל הלון, עדי פייגנבוים, דני שטיינברג, סטנלי פרימן פרק 4. התמודדות עם מחלת הבוטריוספריה בנשירים דוד עזרא, חופית קול מימון, רן שולחני ודני שטיינברג, מעיין גולני פרק 5. פיתוח כלים לאפיון מעבר אוכלוסיות פטריות הבוטריוספריה בין עצי פרי שונים עומר פרנקל, חופית קול מימון; דוד עזרא, דני שטיינברג, סטנלי פרימן, אורנה ליארזי, רן שולחני, מיכל שרון ומיכל הרשקוביץ פרק 6. ניספחים נספח מספר 1: בוטריוספריה באבוקדו: פרוטוקול לייצור חומר ריבוי נקי נספח מספר 2. התמודדות עם בוטריוספריה בנשירים נספח מספר 3. פרוטוקול לטיפול במטעי אבוקדו המשמשים כמקור לחומר ריבוי נספח מספר 4. נימוקי הוועדה שבחרה את עוזרי המחקר של המחלקה לפתולוגיה וחקר העשבים כצוות מצטיין של משרד החקלאות ופיתוח הכפר לשנת 2014 נספח מספר 5. דיווח על ממצאי המיזם 2

3 תקציר מנהלים בשנים האחרונות זוהו בעצי פרי ממינים שונים, בגפני מאכל ויין, בעצי נוי ובעצי יער תסמיני התייבשות של ענפים ובמקרים חמורים אף התמוטטות ותמותה של עצים. בעיה קשה בקנה מידה ארצי נצפתה בנטיעות חדשות ובמיוחד של אבוקדו, אפרסק ונקטרינה. ממשתלות אחדות על תמותה ניכרת בשנים האחרונות כמו כן, דווח של שתילים במהלך הייצור, משלב ההרכבה ואילך; מדובר במאות אלפי שתילים. פגיעה משמעותית נצפתה גם בעצים בוגרים של מיני נשירים שונים ובכלל זה משמש, אפרסק, נקטרינה, שזיף )בחלק מהזנים( ובמטעים בוגרים של אבוקדו. בחודש ינואר הוקם 2014 מיזם ארצי שנקרא חוס"ן בוטריוספריה. המטרות הספציפיות של המיזם, כפי שהוגדרו על ידי הוועדה המקצועית שלו, הם: 1. לאפיין את מקורות המידבק הראשוני העיקריים של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה המנגעות עצי אבוקדו ונשירים; הנגרמות על.2 לפתח גישות ליצור חומר ריבוי של אבוקדו ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה;.3 בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה בנטיעות חדשות של אבוקדו המשמשים כעצי אם. בשנת המיזם השנייה. ונשירים הנקי ממחלות לפתח גישות להתמודדות עם נגיעות ונשירים ובעצים בוגרים בדו"ח זה אנו מדווחים על התוצאות של הבדיקות והניסויים שבצענו במחקר הקשור לאבוקדו, ענינו במהלך שנת המיזם השנייה על כל המטרות שהוגדרו והישגנו, למעשה, את היעד של המיזם. הראינו שמקור המידבק הראשוני העיקרי של המחלה הוא מעצי אם מהם נלקח חומר ריבוי שנראה לכאורה בריא, אך היה למעשה מאוכלס בגורם המחלה; הגדרנו פרוטוקול לייצור של חומר צמחי בריא במשתלות ופיתחנו אמצעים להפחית את התמותה של שתילים צעירים במטעים. לאחר יישום הפרוטוקולים שפיתחנו הפחת במשתלות הוא אחוזים בודדים מהייצור ושכיחות התמותה של שתילים במטעים צעירים ירדה לערכים של 4-6% מהשתילים, שכיחות ברמות המקובלות בענף. מאחר והשלמנו את היעד שהוגדר על ידי וועדת ההיגוי של המיזם, הוטל עלינו להפנות משאבי מחקר גם לפגיעה שגורמת המחלה בעצים מבוגרים. התחלנו לעשות זאת בשנת המיזם השנייה ובדו"ח זה מפורטים הניסויים והבדיקות שבצענו בנושא. של המחלה ניסינו בשנת המיזם השנייה GFP כדי לחקור נושאים שונים הקשורים לבצע לשני תבדידים של הפטריות.L pseudotheobromae ו - הניסויים לטרנספורמציה באמצעות אגרובקטריום ופרוטופלאסטים מתכוונים להמשיך ולנסות ולייצר טרנספורמנטים. לאתיולוגיה ולאפידמיולוגיה טרנספורמציות מולקולריות של הגן המדווח.L. theobromae עדיין לא צלחו. כל שיטות אנחנו בניסוייים שבצענו התברר שתמותה של 3

4 שתילי אבוקדו נגועים במחלה הופחתה באופן מובהק על ידי יישום של התכשיר "קנון", המכיל את החומר הפעיל חומצה זרחיתית. מאחר ומצאנו שהתכשיר אינו פעיל כנגד פטריות )ובהסתמך על מידע מהספרות( הועלתה היפותזה הטוענת כי התכשיר מקנה עמידות לצמחים ע"י הפעלת מנגנון "פרימינג". ממצאי הניסויים והבדיקות שבצענו בשנת המיזם השנייה מרמזים שהטיפול בקנון גורם לעלייה זמנית בביטוי גנים המקודדים לחלבוני Pathogenesis ובירידה ברמת התעתיק של הבקר השלילי של מנגנון ה- SAR, (PRs( related proteins.panpr4 בנוסף, תוצאות אנליזת RNA-Seq הראו כי טיפול קנון משרה שינוי מהותי ברמת הטרנסקריפטום. תוצאות אלו התקבלו במהלך החודש האחרון. כעת, בכוונתנו לבדוק באופן מפורט, ע"י מבחני העשרה של,GO annotation את תוצאות הטרנסקריפטום. אנו מקווים כי מחקר מעמיק יותר יאפשר לקבל תובנות רחבות יותר באשר לאופן בו קנון משרה עמידות בשתילי אבוקדו. תובנות אלו עשויות לא רק לתרום להבנה מעמיקה של הנושא אלא לתרום בגיבוש פרוטוקול יעיל יותר לטיפול בתכשיר במטעים. במחקרים שעסקו בנשירים מצאנו כי חומר הרכב הנמצא בבית המקור המשמש להספקת רכב למשתלות הנשירים נגוע בפטריות כולל כאלה המשתייכות לקבוצת הבוטריוספריה ובייחוד בפטריות Neoscytalidium dimidiatum ו - sp..lasiodiplodia בנוסף נצפו על העצים גופי פרי של פטריות רקב שונות. בשנת המיזם הנוכחית בדקנו את מעורבותן של פטריות הרקב בנוסף למעורבות פטריית ה - Neoschytalidium בתופעה. בנוסף, בחנו את יעילות השימוש בשני חומרי הדברה במטרה לנקות את חומר הרכב מגורם המחלה. בחנו גם את נוכחות הפטרייה בחלקים שונים של חומר הרכב הנלקח מעצים במטע ומצאנו שהאיבר הצמחי המאולח הוא הפקעים )העיניים( ולא המפרקים. בנוסף, ביצענו ניסויים בהם בחנו את הפעילות של התכשיר קנון במניעת התמותה בעצ"פ הנשירים. כדי לבחון באם הפתוגנים המרכזיים מקבוצת הבוטריוספריה בארץ )כלומר LT, LPT ו - dimidiatum.n( יכולים לעבור בין מאכסנים שונים וכדי ללמוד ולהבין מהם מקורות המדבק הראשוניים והשניוניים פיתחנו פיתוח כלים מולקולריים ופילוגנטים לזיהוי קבוצות גנטיות שונות ברמות המינים ואוכלוסיות בתוך מיני הפתוגנים. לאחר מכן השתמשנו בכלים לזיהוי מבנה האוכלוסיות הפתוגן בדגש על הבדלים במבנה אוכלוסיות הפתוגנים על גבי מאכסנים שונים. מבדיקה ראשונית בלבד של הסמנים על אוכלוסיות הפתוגנים, נראה כי קיימים מספר הפלוטיפים גנטיים על מאכסנים שונים וכי ההתאמה למאכסן איננה הגורם היחיד המכתיב את מבנה האוכלוסיות. נושא זה ייבדק לעומק בשנת המיזם השלישית. 4

5 פרק 1: התמודדות עם מחלת הבוטריוספריה באבוקדו דו"ח לשנת המחקר השנייה המוגש לוועדת ההיגוי של מיזם חוס"ן בוטריוספריה ע"י דני שטיינברג, סטנלי פרימן, רן שולחני, מנחם בורנשטיין המחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר העשבים, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן אלי סימנסקי חברת נבטים, מושב כרמל מעין גולני חברת לוכסמבורג תעשיות בע"מ, תל-אביב יונתן מעוז מועצת הצמחים 1. תקציר בשנים האחרונות זוהו במטעי אבוקדו צעירים תסמיני התייבשות של ענפים ובמקרים חמורים אף התמוטטות ותמותה של שתילים. בחלקות רבות אחוזי ההתייבשות והתמותה הגיעו ל 30% מהשתילים ויותר. בנוסף דווח על תמותה ניכרת של שתילים במשתלות במהלך הייצור, משלב ההרכבה ואילך; דובר בפחת שהגיע ל 20% מהשתילים המיוצרים, ויותר. בסך הכול מתו מאות אלפי שתילים ועצים צעירים. היעד של מיזם חוס"ן בוטריוספריה, כפי שהוגדר על ידי וועדת ההיגוי לפני תחילת המיזם היה "פיתוח גישות ליצור חומר ריבוי נקי ולהתמודדות עם נגיעות קיימת בשתילים צעירים ממחלות הנגרמות על ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה באבוקדו, אפרסק ונקטרינה". לגבי המחקר הנוכחי, המטרות הספציפיות שנקבעו על ידי החוקרים המעורבים והוועדה המקצועית היו: 1. לאפיין את מקורות המידבק הראשוני העיקריים של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה המנגעות עצי אבוקדו;. 2 לפתח גישות ליצור חומר ריבוי של אבוקדו הנקי ממחלות הנגרמות על ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה; ו 3. לפתח גישות להתמודדות עם מחלת הבוטריוספריה בנטיעות צעירות. למיטב הבנתינו, במהלך שנת המיזם השנייה ענינו על כל המטרות שהוגדרו והישגנו, למעשה, את היעד של המיזם. הראינו שמקור המידבק הראשוני העיקרי של המחלה הוא מעצי אם מהם נלקח חומר ריבוי שנראה לכאורה בריא, אך היה למעשה מאוכלס בגורם המחלה; הגדרנו פרוטוקול לייצור של חומר צמחי בריא במשתלות ופיתחנו אמצעים להפחית את התמותה של שתילים צעירים במטעים. לאחר יישום הפרוטוקולים שפיתחנו הפחת במשתלות הוא אחוזים בודדים מהייצור ושכיחות התמותה של שתילים במטעים צעירים ירדה לערכים של 4-6% מהשתילים, שכיחות ברמות המקובלות בענף. מאחר והשלמנו את היעד שהוגדר על ידי וועדת ההיגוי של המיזם, הוטל עלינו להפנות משאבי מחקר גם לפגיעה שגורמת המחלה בעצים מבוגרים. התחלנו לעשות זאת בשנת המיזם השנייה ובדו"ח זה מפורטים הניסויים והבדיקות שבצענו בנושא. בשנת המיזם השלישית נתרכז בחקר הגורמים המשפיעים על התפתחות המחלה בעצים בוגרים ועל דרכי ההתמודדות עימה. 5

6 2. מבוא בשנים האחרונות זוהו במטעי אבוקדו צעירים תסמיני התייבשות של ענפים ובמקרים חמורים אף התמוטטות ותמותה של שתילים. בחלקות רבות אחוזי ההתייבשות והתמותה הגיעו ל 30% מהשתילים ויותר. התסמינים נצפו בכל רחבי הארץ מהנגב בדרום ועד עמק החולה והגליל המערבי בצפון. בנוסף דווח על תמותה ניכרת של שתילים במשתלות במהלך הייצור, משלב ההרכבה ואילך; דובר בפחת שהגיע ל 20% מהשתילים המיוצרים, ויותר. בסך הכול מתו מאות אלפי שתילים ועצים צעירים. גם במטעים בוגרים נצפו תסמיני מחלה שכללו התייבשות של ענפים ברמות חומרה שונות: מהתייבשות של ענפים בודדים במטע ועד להתייבשות של ענפי שלד בעצים רבים במטע. מרקמות צמחיות סימפטומטיות בודדנו ברוב המקרים )אבל לא באופן בלעדי( פטריות המשתייכות למין Botryosphaeria ובמיוחד (LT) Lasiodiplodia theobromae ו - Lasiodiplodia (LPT).pseudotheobromae הזיהוי אומת בשיטות מולקולאריות. בהסתמך על התצפיות שבצענו העלנו את ההיפותזה שמקור המידבק ההתחלי העיקרי הוא עצי אם נגועים. השתלנים לוקחים חומר ריבוי המאוכלס בגורם המחלה בצורה א-סימפטומטית )בלי לדעת כמובן( ומייצרים ממנו שתילים. במהלך הייצור במשתלה הפטרייה המאכלסת את השתילים הצעירים מתפתחת וגורמת למחלה שממנה מתים חלק מהשתילים הנגועים עוד במשתלה. בשתילים אחרים גורם המחלה מקנן, בלי לגרום להתפתחות משמעותית של תסמינים, והשתילים האלה נמכרים לנוטעים בלי שאף אחד יהיה מודע לכך שהם למעשה נגועים. השתילים הנגועים נשתלים במטעים ובמהלך השנה הראשונה והשנה השנייה שלאחר השתילה גורם המחלה מתפרץ וחלק מהשתילים המאוכלסים מתייבשים ומתים. שתילים אחרים מצליחים להתגבר על גורם המחלה ומתחמקים. בהסתמך על היפותזות העבודה שתוארה המטרות הספציפיות של המחקר הנוכחי, כפי שהוגדרו על ידי הוועדה המקצועית של המיזם, היו כלהלן: 1. לאפיין את מקורות המידבק הראשוני העיקריים של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה המנגעות עצי אבוקדו; הנקי ממחלות הנגרמות על ידי פטריות מקבוצת לפתח גישות ליצור חומר ריבוי של אבוקדו 2. הבוטריוספריה; לפתח גישות להתמודדות עם מחלת הבוטריוספריה בנטיעות צעירות בגלל ההצלחות של המחקר באבוקדו וועדת ההיגוי הוסיפה במהלך שנת המיזם השנייה מטרה נוספת, כלהלן: לפתח שיטות להתמודדות עם מחלת הבוטריוספריה במטעי אבוקדו מבוגרים. המחקרים שבוצעו לפני שהמיזם התחיל, ואלו שבוצעו בשנת המיזם הראשונה, אוששו, בעיקרון, את ההיפותזה שתוארה לעיל )מטרה 1(. הראינו שעצי האם של האבוקדו אכן מאולחים בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה; הוכחנו שהמחלה מאכלסת בצורה סמויה את חומר הריבוי; הראינו שהמחלה מתפרצת במשתלות כאשר נעשה שימוש בחומר ריבוי מאוכלס ומצאנו שבעקבות הרכבה של רוכב מאוכלס בגורם המחלה על כנה בריאה מתפתחים תסמיני המחלה האופייניים ברוכב ולאחר זמן התסמינים מתקדמים ומגיעים גם לכנה. בשנת המיזם השנייה התרכזנו במחקרים שמטרתם הייתה לפתח גישות ליצור חומר ריבוי נקי )מטרה 2(. כדי לשנות את המצב מבסיסו, השירותים להגנת הצומח, שה"מ, המגדלים ונציגיהם במועצת הצמחים, בצעו מהפכה בשתלנות האבוקדו בארץ. כל עצי האם של האבוקדו שהיו מורשים על ידי השירותים להגנת הצומח נפסלו, ובמקומם אושרו מספר קטן של מטעי אבוקדו באזור הגליל המערבי. מטעים אלה נמצאו נקיים מגורם המחלה והשתלנים אמורים לקחת חומר ריבוי רק ממטעים אלה. בנוסף, בחנו את היעילות של תכשירי הדברה שונים כנגד הפטריות מחוללות המחלה ופיתחנו פרוטוקול לטיפול בחומר הצמחי במשתלות. הפרוטוקול מיושם כבר על ידי כל המשתלות בארץ. התחלנו גם בניסויים שהתמקדו בפיתוח גישות להתמודדות עם נגיעות בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה בנטיעות חדשות של אבוקדו והתווינו פרוטוקול בעצים בוגרים המשמשים כעצי אם. בשנת המיזם השנייה גם עסקנו בחיפוש פתרונות להתמודדות עם הבעיה במטעים קיימים, צעירים ומבוגרים )מטרות 3 ו 4(. ההנחה היא שחלק מהעצים במטעים מאוכלסים בגורמי המחלות. בניסויים ראשוניים בחנו באם השימוש בתכשיר קנון, שאינו פעיל ישירות כנגד הפטריות אלא משפעל את מערכת ההגנה הטבעית של העצים, מפחית את התמותה של שתילים צעירים ומשפר את המצב התברואתי של עצים מבוגרים. בנוסף בחנו נושאים שונים הקשורים להופעת תסמיני התייבשות על תפרחות במטעים מסחריים. 6

7 ה) מיזם חוס"ן בוטריוספריה. דו"ח לשנת המחקר השנייה 3. תיאור הניסויים שבוצעו 3.1 פיתוח גישות לייצור חומר ריבוי של אבוקדו הנקי ממחלות הנגרמות על ידי בוטריוספריה שימוש במקור רכב בריא כפי שצוין במבוא ההיפותזה שעמדה בבסיס המחקר הנוכחי היא שמקור המידבק העיקרי של גורם המחלה בנטיעות הצעירות הוא חומר ריבוי )רוכבים( מאוכלס בגורם המחלה שנלקח מעצי אם נגועים. כדי לבחון היפותזה זו, וכדי לאפיין את המועדים בשנה בהם קיים סיכון שחומר הריבוי מאוכלס בגורם המחלה, נדגמו מחלקת אבוקדו מהזן האס במח"ע )נטיעת 2005( ענפונים חד-שנתיים עשבוניים, הדומים לאלה אותם לוקחים השתלנים לשימוש ככנות. חשוב לציין שהעצים בחלקה זו נגועים מאד במחלה ושהיא לא משמשת בפועל כמקור ללקיחת חומר ריבוי. הדגימות נעשו במועדים שונים החל מחודש מרץ 2014 ועד היום. בכל מועד, נדגמו ענפונים עשבוניים שלא נראו עליהם תסמינים כל שהם. הענפונים הובאו למעבדה, חוטאו חיצונית באקונומיקה 1% למשך דקה ולאחר מכן נחתכו למקטעים בגודל של חצי ס"מ לערך שהונחו בצלחות פטרי על גבי מצע מזון )0.5%,)PDA; 5 מקטעים בצלחת. הצלחות הודגרו בחדר גידול בטמפרטורה של 2±22 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים הצלחות נסקרו ויזואלית ונקבע באם התפתחו עליהן מושבות של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה. הממצאים שימשו לקביעת שכיחות הענפונים העשבוניים שהיו מאוכלסים בגורם המחלה בכל מועד דגימה ולאורך זמן. פטריות מקבוצת הבוטריוספריה מאכלסות חומר צמחי יבש. מסיבות שונות מקובל כיום לגרוס את הגזם ולהשאירו במטע. נשאלת השאלה באם גורם המחלה שורד בגזם, ולכמה זמן. במידה ויתברר שגורם המחלה אכן שורד בגזם הגרוס לאורך זמן יש חשש שזה ישמש כמקור מידבק לעצים הבריאים הסמוכים. במידה וכך הדבר, יש להרחיק את הענפים היבשים מהמטע ולשרוף אותם. כדי לברר במשך כמה זמן שורד גורם המחלה בגזם גרוס, ובאם חיפוי סולארי יקצר את משך ההישרדות, ביצענו בבית דגן ניסוי שבחן שאלות אלה. עוצמת הקרינה והטמפרטורה משפיעים על משך ההישרדות של פגעים בשאריות צמחים. שני מדדים אלה משתנים באופן גלובלי במהלך חודשי השנה )כתלות במזג האוויר( ובצורה מקומית כתלות במידת החשיפה לשמש. כך למשל, במקום החשוף לשמש ישירה עוצמת הקרינה והטמפרטורה גבוהים יותר מאשר במקום מוצלל. כדי הניסוי בוצע בחודשים מאי-אוגוסט בהם עוצמת הקרינה בישראל מרבית. הוא הוצב ב 15 במאי ונכללו בו כמה טיפולים שנבדלו זה-מזה בעוצמת הקרינה ובטמפרטורה. יצרנו שונות בעוצמת הקרינה על ידי שימוש ברשתות צל בעלות חדירות שונה לקרינת השמש. הניסוי כלל את הטיפולים הבאים: 1. קרינת שמש ישירה )100%(; 2. רשת צל החוסמת 30% מהקרינה; 3. רשת צל החוסמת 50% מהקרינה; 4. רשת צל החוסמת 70% מהקרינה; 5. רשת צל החוסמת 85-90% מהקרינה; 6. כיסוי בפלריג שחסם 95% מהקרינה. שונות בטמפרטורה אליה נחשף החומר הצמחי נוצרה על יישום, או אי-יישום, של חיטוי סולארי. ענפים נגועים של אבוקדו מהזן האס מהמטע של מח"ע, הנגוע מאד בגורם המחלה, רוסקו באמצעות מרסקת מסחרית. הרסק שכלל מקטעי ענפים ועלים הוכנס לשקי רשת. שקי הרשת הורטבו במים וכוסו באמצעות יריעת פוליאתילן טיפול הסולארי(, או שהם הונחו ישירות על פני הקרקע - מתחת לרשתות הצל השונות. שקי רשת גם הוצבו חשופים לקרינת שמש ישירה עם, וללא חיפוי סולארי )איור מספר 1(. מידי שבועיים-שלושה עד ל 16 באוגוסט ) ימים בסך הוכל(, נלקחו דגימות של רסק ענפים מכל אחד מהטיפולים. הדגימות נחתכו למקטעים בגודל של חצי ס"מ ואלה הונחו בצלחות פטרי על גבי מצע מזון )0.5%.)PDA; הצלחות הודגרו בחדר גידול בטמפרטורה של 2±22 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים הצלחות נסקרו ויזואלית ונקבע באם התפתחו עליהן מושבות של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה. הממצאים שימשו לקביעת שכיחות הדגימות שהיו מאוכלסות בגורם המחלה בכל דגימה ולאורך זמן. נתונים אלה שימשו לחישוב השטח היחסי שמתחת לעקום שכיחות האכלוס לאורך הזמן ( the RAUCPC = Relative Area Under.)Colonization Progress Curve היחידות של ערכי ה RAUCPC הם אחוזים. ערך RAUCPC של 100% מבטא מצב בו כל הדגימות היו מאוכלסות לאורך כל זמן הניסוי; ערך של 30% מבטא מצב בו במשך הזמן הייתה קטילה הפטרייה ב - 70% מהדגימות לאורך הניסוי. הטמפרטורה והלחות נמדדו באופן רציף בכל הטיפולים באמצעות קוראי נתונים אלקטרוניים מהסוג.HOBO נתוני הטמפרטורה שימשו לחישוב סכום החום המצטבר )שעות מעלה מעל לסף של 0 מעלות( מתחילת הניסוי ועד לסיומו. 7

8 איור מספר 1. מבט כולל לאזור הניסוי שבוצע במכון וולקני לבחינת ההשפעה של עוצמת הקרינה והטמפרטורה על הישרדות פטריות מקבוצת הבוטריוספריה בחומר צמחי גרוס. א. צילום כללי של הניסוי בו נראים המבנים של בתי רשת הצל שנבנו; ב. שקי רשת המכילים חומר צמחי מאולח, גרוס; ג. יריעת פוליאתילן המכסה את שקי הרשת שהכילו לומר צמחי מאולח, גרוס )טיפול החיטוי הסולארי( פיתוח פרוטוקול לטיפול ברכב לפני ההרכבה כדי להפחית את הסבירות שיעשה במשתלה שימוש ברכב מאוכלס בגורם המחלה פותח פרוטוקול לטיפול ברכב, לפני ההרכבה. על פי הפרוטוקול יש לטבול את הרכב בתמיסה מימית המכילה את תכשירי ההדברה סוויץ )0.1%( ודלסן )0.1%( למשך 5 דקות. בניסויים שבצענו במכון וולקני בחנו את יעילות הטיפול המומלץ. בניסוי נעשה שימוש בחומר צמחי שאולח בהדבקה מלאכותית עם הפטריות LT או.LPT שתילי אבוקדו מהזן האס שגדלו בחממה רוססו בתרחיף נבגים של הפטריות בריכוז של נבגים לסמ"ק. שתילים אחרים רוססו במים )היקש(. לאחר חמישה ימים נלקחו ענפים עשבוניים שלא נראו עליהם כל תסמיני מחלה הדומים לאלה המשמשים כרכב במשתלות המסחריות. הענפים העשבוניים נחתכו למקטעים באורך של 7-10 ס"מ והם שימשו כרכב בניסוי. הרכב הורכב על שתילי אבוקדו אחרים מהזן האס שגדלו בחממה אחרת. שתילים אלה שימשו כ"כנה". כחודש לאחר ביצוע ההרכבות נערכה תצפית ונרשם באם ההרכבות הצליחו. הרכבות נחשבו כמוצלחות באם לבלבו על הרוכב עלים חדשים. בנוסף נרשם באם התפתחו על הרוכב תסמיני המחלה האופייניים ובאם התסמינים נראו גם על הענף ששימש ככנה )איור מספר 2(. הממצאים שימשו לחישוב שכיחות ההרכבות החיוניות בכל טיפול. 8

9 איור מספר 2. בחינת היעילות של טיפול בחומר ריבוי מאולח. א. הרכבה של רוכב שנראה בריא )א-סימפטומטי( על שתיל ששימוש ככנה; ב. הרכבה חיונית לבלוב התפתח על הרוכב המורכב; ג. הרכבה לא חיונית תסמיני המחלה האופייניים התפתחו על הרוכב וממנו עברו לכנה. החיצים הצהובים מציינים את אזור ההרכבה. 3.2 פיתוח גישות למניעת תמותה של עצים בנטיעות צעירות השריית עמידות באמצעות התכשיר קנון בנטיעות התכשיר קנון )50 ;canon ת"נ המכיל 780 גר' מלח אשלגן זרחיתי בליטר( המשווק על ידי חברת לוכסמבורג תעשיות בע"מ אינו פעיל כנגד פטריות מקבוצת הבוטריוספריה. החומר משפעל את המערכת החיסונית של צמחים כנגד פגעים )ראה פרק 3 בדו"ח זה'(. כדי לבדוק באם התכשיר משפיע על הישרדות שתילים מאוכלסים שכבר נטועים במטעים, העמדנו בראשית שנת 2014 ששה ניסויים ותצפית אחת במטעי אבוקדו מסחריים. המטעים בהם בוצעו הניסויים נשתלו במהלך השנים 2012 ו 2013 ובכולם מתו שתילים לפני התחלת הניסויים. השתילים מתו מאחר וחומר הריבוי בו נעשה שימוש נלקח מעצי האם הנגועים. שכיחות השתילים שמתו השתנתה ממטע למטע, אבל בכולם שכיחות התמותה לפני שהתחלנו בניסויים הייתה גבוהה מ - 10%. בכל המקרים, השתילים שמתו הוחלפו על ידי הנוטעים. הניסויים שבוצעו בכפר מסריק, כינרת ולהבות חביבה )חלקות 35 ו 36( כללו שני טיפולים: היקש וריסוס בקנון. בתצפית שבוצעה בחלקות בלהבות חביבה ובניסויים שבוצעו בכפר גליקסון, במעין צבי-נחשולים וברגבה, בנוסף לשני טיפולים אלה היו טיפול נוסף בו הקנון יושם בהגמעה וטיפול רביעי בו יושמו במשולב ריסוס+הגמעה. בכל הניסויים יושם הטיפול הראשון )ריסוס, הגמעה או ריסוס+הגמעה( בחודשים ינואר-פברואר הטיפולים העוקבים יושמו מידי חודש עד חודשים. בניסויים שבוצעו בכפר מסריק, בכינרת, בלהבות חביבה )הניסוי והתצפית( וברגבה, הטיפולים נמשכו עד לחודשים יולי-אוקטובר 2014, ויושמו בהם 6-7 טיפולים בסך הכול. בניסויים שבוצעו בכפר גליקסון ובמעין צבי-נחשולים הטיפולים נמשכו עד לחודשים ספטמבר-אוקטובר 2015 ויושמו בהם 11 או 13 טיפולים בסך הכול, בהתאמה. הריסוסים יושמו באמצעות מרססי הרובים של המשק בריכוז של 0.5% תכשיר, בנפח ריסוס של ליטר לדונם. לתרסיס הוסף משטח 77-L בריכוז של 0.025%. ההגמעה יושמה באמצעות מערכת ההשקיה הרגילה של המטעים בהם בוצעו הניסויים וכמות החומר בה נעשה שימוש הייתה ליטר וחצי לדונם. הניסויים התפרסו על פני חלקות גידול שלמות בגודל של עשרות דונמים. כל טיפול חזר 3-4 פעמים וגודל כל חזרה היה 100 עצים ויותר. במועד העמדת הניסויים רשמנו את מספר השתילים שמתו לפני תחילת הניסוי זו הייתה ספירת האפס. לאחר העמדת הניסויים בצענו הערכות נגיעות מידי 4-6 חודשים. בכל הערכה נסרקו כל העצים שגדלו בשורות הדגימה ונרשם מספר העצים שמתו ממועד ההערכה הקודם. מאחר ומספר העצים הכולל בכל שורת דגימה ובכל חזרה היה ידוע, ניתן היה לחשב את שכיחות העצים שמתו בכל חזרה מההערכה הקודמת. הנתונים שימוש לחישוב שכיחות השתילים המתים לכל טיפול. בארבעה ניסויים בחנו באם הטיפול בקנון משפיעה על קצב הגדילה של השתילים על ידי מדידה של קוטר הגזע, בגובה של סמ' מעל פני הקרקע. המדידה התבצע באמצעות קליבר. בכל חזרה נמדד הקושר של 10 עצים עוקבים. הנתונים שימשו לחישוב שטח החתך של הגזע )בהתבסס על ההנחה שהגזע הוא עגול(. 9

10 3.2.2 השריית עמידות באמצעות התכשיר קנון בנטיעות 2014 בסוף שנת 2014 ובתחילת שנת 2015 הצבנו עוד ארבעה ניסויים לבחינת היעילות של הקנון. ניסויים אלה הועמדו בחלקות אבוקדו מסחריות שניטעו בשנת חומר הריבוי בו נעשה שימוש בנטיעות אלה כבר טופל במשתלות בהתאם לפרוטוקול ייצור השתילים החדש. הניסויים הוצבו בבני ציון, בנירים ובכפר גליקסון )שני ניסויים(. בנירים ובבני ציון הניסויים כללו חלקות היקש וחלקות שרוססו בקנון במרסס הרובים המשקי; שני הניסויים שהועמדו בכפר גליקסון כללו שני טיפולים נוספים הקנון יושם גם בהגמעה וגם בריסוס+הגמעה. ריכוז התכשירים ותכיפות הטיפולים היו דומים לאילו שפורטו בסעיף לעיל. גם בניסויים אלה נרשם מספר השתילים המתים בכל חלקת ניסוי לפני תחילת הטיפולים )הערכת אפס( וההערכות העוקבות בוצעו מידי 4-6 חודשים. כל ניסוי כלל 4 חזרות ובכל חלקת ניסוי היו 100 עצים ויותר. 3.3 פיתוח גישות לשיפור המצב התברואתי של מטעי אבוקדו מבוגרים במהלך שנת 2014 ביצענו שבעה ניסויים ותצפיות בהם בחנו את ההשפעה של הגמעה בקנון על המצב התברואתי של עצי אבוקדו מבוגרים. תצפית נוספת הועמדה בקיבוץ זיקים על ידי המגדל )פסקל(. הניסויים והתצפיות הועמדו במטעי אבוקדו מהזן האס, אטינגר וגליל בהם היו התייבשויות ברמות שונות. ההתייבשויות נגרמו, כפי הנראה, על ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה אבל לא מן הנמנע שהיו גם גורמים אחרים. בכל ניסוי או תצפית היו שני טיפולים: היקש והגמעה בקנון. התכשיר יושם דרך מערכת הטפטוף המשקית במינון של 1.5 ליטר לדונם מידי חודש וחצי עד חודשיים. הניסויים כללו שלוש עד חמש חזרות שבכל אחת מהן היו עשרים עצים ויותר. כחצי שנה ויותר לאחר התחלת הטיפולים הערכנו את השפעת הטיפולים על בריאות העצים. ההערכות בוצעו על ידי שני דוגמים שהסתכלו על כל אחד מהעצים שהיו בחלקות הדגימה משני הצדדים והעריכו את מידת ההתייבשות של כל עץ בנפרד. ההערכה התבססה על סולם של 4 דרגות, כלהלן: = 0 לא היו על העץ ענפים יבשים; = 1 היו על העץ מעט ענפים יבשים )עד 2 ענפים בממוצע(; = 2 הייתה על העץ כמות בינונית של ענפים יבשים )3-5 ענפים, בממוצע(; = 3 הייתה על העץ כמות גדולה של ענפים יבשים )יותר מ 6 ענפים, בממוצע(. כשלא הייתה זהות בדרגה אותה העריכו שני הדוגמים נרשמה הדרגה הגבוהה יותר. לשם ניתוח הנתונים חושבה עבור כל חזרה השכיחות של העצים שהיו בכל דרגת נגיעות. לאחר מכן נבחן באם היו הבדלים מובהקים בערכי השכיחות בכל דרגה בין השני הטיפולים. לשם כך השתמשנו 2 במבחן של x. 3.4 בחינת הגורמים להתייבשות תפרחות במטעי אבוקדו מבוגרים השפעת סוג הכנה על התייבשות תפרחות במטע אבוקדו של המגדל פנטי בעמק חפר, העמיד דר' ליאו וינר ניסוי לבחינת ההתאמה של כנות אבוקדו שונות לתנאי האזור. הנטיעה הייתה בשנת 2011 והניסוי כלל חמש כנות שבכולן הזן הוא האס. הניסוי הוצב במתכונת של אקראיות גמורה עם ארבע חזרות שבכל אחת מהן ששה עצים. באביב 2015, אחרי גל החום הכבד שהיה אז, נשרו פרחים וחנטים מתפרחות רבות של עצי הניסוי )כך קרה גם במטעים אחרים בכל רחבי תסמינים הדומים לאילו הנגרמים על ידי מחלת התפתחו לאחר מכן חלק מהתפרחות הארץ(. על הבוטריוספריה )ראה סעיף 4.4 להלן(. במהלך חודש יוני 2015 ביצענו בניסוי הערכה בה שני דוגמים סקרו כל בתסמיני נגיעותם ונרשמו מדדים שונים הקשורים להתפתחותם, לבריאותם וגם למידת אחד מהעצים התייבשות )המחלה?( התפרחות. המדדים שנרשמו היו כלהלן: צבע העלווה: 1= עלווה בצבע ירוק בהיר; = 2 עלווה בצבע ירוק כהה; פוטנציאל עומס היבול: 1= היבול הפוטנציאלי היה נמוך; 2= היבול הפוטנציאלי היה גבוה. היבול הפוטנציאלי נקבע על פי מספר התפרחות שהיו על העץ. לא ניתן היה להתייחס לעומס היבול בפועל כי פרחים וחנטים בתפרחות רבות נשרו..VC-320 =5 ו VC-65 = 4 ;VC-51 = 3 ;VC-28 =2 הכנה: 1 =דגניה ;117 כמות התפרחות עם תסמיני ההתייבשות: = 0 אין תפרחות עם תסמיני התייבשות; 1 =כמות קטנה )עד 3 תפרחות לעץ(; = 2 כמות בינונית )5-8 תפרחות לעץ(; = 3 כמות גדולה )יותר מ 10 תפרחות עם תסמיני התייבשות לעץ(. 10

11 לשם ניתוח הנתונים חושבה השכיחות של העצים בכל חזרה שפוטנציאל היבול שלהם היה גבוה ושכיחות העצים בכל חזרה שכמות התפרחות שנראו עליהן תסמיני התייבשות הייתה בינונית או גדולה )דרגות 2+3( סניטציה של רקמות צמחיות סימפטומטיות לאחר הפריחה שהתרחשה באביב 2015 נראו במטע האבוקדו מהזן ריד של קיבוץ יקום התייבשויות של התפרחות בהיקף משמעותי. עם חלוף הזמן התפתחו ההתייבשויות ועברו לענפים והיו עצים שנפגעו באופן קשה כתוצאה מכך. בחלק מהעצים לא היה כלל יבול. בחודש אוגוסט 2015 העמדנו במטע זה ניסוי לבחינת היעילות של טיפול סניטציה. בשלב הראשון הוערכה מידת הנגיעות של כל העצים שהיו בשתי השורות שהועמדו לרשותנו על ידי הנוטע. השתמשנו בסולם האיכותי שפורט בסעיף לעיל אבל בגלל שבחלק מהעצים הייתה פגיעה משמעותית מאד, הוספה דרגת חומרה נוספת, דרגה חמישית המבטאת נגיעות חמורה מאד. לאחר שכל העצים הוערכו הם חולקו לשתי קבוצות על פי מידת הפגיעה שלהם והעצים בכל קבוצה הוגרלו אקראית לשת קבוצות שבכל אחת מהן היו ששה עצים. בשלב הבא הוגרלו הטיפולים והעצים סומנו. הטיפולים היו: 1. היקש, בו הרקמות הצמחיות הנגועות לא הוסרו ו 2. סניטציה, בו נגזמו והורחקו כל הרקמות הצמחיות הסימפטומטיות. לאחר הסימון גזמנו את כל הרקמות הסימפטומטיות מהעצים שהוגרלו לטיפול מספר 2. בזמן העמדת הניסוי נלקחה דגימה של ענפים חד-שנתיים עשבוניים לבדיקת איכלוסם בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה, כפי שתואר בסעיף בהמשך, ביצענו מידי שלושה-ארבעה חודשים הערכות נגיעות על העצים שנכללו בניסוי. בכל מועד הערכה גם דגמנו ענפים חד-שנתיים עשבוניים ובחנו באם הם מאוכלסים בפטריות מחוללות המחלה. הניסוי עדיין לא הסתיים ואנחנו מתכוונים להמשיכו עד לאחר עונת הקטיף של תוצאות 4.1 פיתוח גישות לייצור חומר ריבוי של אבוקדו הנקי ממחלות הנגרמות על ידי בוטריוספריה שימוש במקור רכב בריא כדי לאפיין את המועדים בשנה בהם קיים סיכון שחומר הריבוי יהיה מאוכלס בגורם המחלה, נדגמו מחלקת אבוקדו ממח"ע ענפונים חד-שנתיים עשבוניים הדומים לאלה אותם לוקחים השתלנים לשימוש כרוכבים. היו הבדלים בשכיחות האכלוס של הענפונים כתלות במועד הדגימה בשנה: שכיחות האכלוס הייתה גבוהה יותר בחודשי החורף )נובמבר-ינואר( מאשר בחודשי הקיץ )אפריל-יולי(. אבל בכל מועדי הדגימה היו ענפונים שהיו מאוכלסים בגורם המחלה )איור מספר 3(. איור מספר 3. איכלוס של ענפים חד-שנתיים עשבוניים שנדגמו ממטע אבוקדו במח"ע בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה כתלות במועד הדגימה בשנה. 11

12 לאחר שהתברר שעצי האם המורשים ללקיחת רכב נגועים בפטריות מקבוצת הבוטריוספריה, השירותים להגנת הצומח פסלו את כל העצים. לחילופין, הם איתרו יחד עם אנשי שה"מ ומועצת הצמחים מספר מטעים בצפון הארץ שלא היו בהם תסמיני התייבשות של ענפים האופייניים למחלת הבוטיוספריה והכשירו אותם כמטעי-אם ללקיחת חומר ריבוי על-ידי השתלנים. מאחר וגורם המחלה מופץ באוויר, לא ניתן, כמובן, למנוע באופן מוחלט את התפתחות המחלה גם במטעים הללו. אבל צריך לעשות את המרב כדי להגן על העצים ולהפחית את הסבירות שתתפתח בהם מחלה. כדי לשמור על בריאות העצים פותח פרוטוקול שנכתב על ידי מיקי נוי )ממ"ר אבוקדו בשה"מ( וראול קלינרמן )מהשירותים להגנת הצומח(. הפרוטוקול מפרט את דרכי הטיפול השגרתי במטעי עצי האם ואת הדרך בה יילקח חומר הריבוי ממטעים אלה. הפרוטוקול מצורף בנספח מספר 1 של דו"ח זה. בביקור שבצענו במטע בחניתה בחודש אפריל 2015 התרשמנו מבריאות העצים במטע. אבל, כצפוי, היו במטע מעט ענפים יבשים. ההתייבשות לא נגרמה בהכרח מהתפתחות גורם המחלה אבל בגלל שהפטריות מקבוצת הבוטריוספריה תוקפות ומתפתחות על חומר צמחי יבש לא מן הנמנע שהן יאכלסו את הענפים היבשים. הענפים היבשים נגזמו על ידי המגדל ורוכזו בשבילים המרכזיים הנמצאים בין שורות העצים )איור מספר 4(. איור מספר 4. תמונות שצולמו בחודש אפריל 2015 במטע עצי האם של הזן האס בחניתה. א. שבר של ענף יבש שנמצא ליד אחד מהעצים; ב. ריכוז של ענפים יבשים בשביל המרכזי בין העצים במטע. הפתרון המקובל לטיפול בגזם המרוכז בשבילים שבין העצים הוא לרסק אותו במרסקת מסחרית. כדי לבחון באם פטריות מקבוצת הבוטריוספריה המאכלסות את הענפים היבשים שורדות בגזם, ולכמה זמן, ביצענו ניסוי במכון וולקני. בניסוי בחנו את ההשפעה של עוצמת הקרינה ואת היעילות של טיפול סולארי על משך ההישרדות של הפטרייה ברסק גזם. גם לאחר חשיפה לעוצמת קרינה מלאה במשך שלושה חודשים הפטרייה לא נכחדה ממרבית קטעי הגזם המאוכלסים )איור 5 א(. כמובן שלהצללה לא הייתה כל השפעה. חיפוי סולארי הפחית במובהק את שכיחות האכלוס, אבל ההשפעה לא הייתה מוחלטת )"רק" 50% הפחתה( והיא התקבלה רק בחשיפה לקרינה מלאה. הצללה של 30% )=קרינה של 70%( ביטלה את האפקט של החיפוי הסולארי )איור מספר 5 ב(. במדידות של הטמפרטורה נמצא שקטעי הגזם המאוכלסים שנחשפו לקרינת שמש ישירה היו בטמפרטורות בטווח של מעלות צלזיוס; אלה שהיו מתחת לחיפוי הסולארי בקרינה מלאה נחשפו לטמפרטורות בטווח של מעלות צלזיוס ואילו שהיו מתחת לחיפוי הסולארי בהצללה של 30% נחשפו לטמפרטורות של מעלות צלזיוס בלבד. נמצא קשר מובהק בין סכום החום המצטבר במהלך הניסוי )שנמשך 94 ימים( להישרדות הפטריות מחוללות המחלה בקטעי הגזם המאוכלסים. אבל, גם בטיפול בו קטעי הגזם נחשפו לסכום החום הרב היותר הקטילה של הפטריות הייתה חלקית בלבד )איור מספר 5 ג( פיתוח פרוטוקול לטיפול ברכב לפני ההרכבה בניסוי שבצענו במכון וולקני בחנו את יעילות הפרוטוקול שפותח לטיפול ברכב החשוד כמאוכלס בפטריות המחוללות את מחלת הבוטריוספריה. כאשר השתמשנו ברכב בריא )שלא אולח בפטריות( שכיחות ההרכבות 12

13 החיוניות היה כ 78%. הרכבה של רכב מאוכלס )ללא שנראו עליו תסמינים( הפחית את שכיחות ההרכבות החיוניות במובהק, כאשר הפטרייה LPT הייתה אלימה יותר מאשר הפטרייה.LT טבילת חומר הריבוי המאולח בתמיסה של סוויץ+דלסן שיפרה את המצב ושכיחות ההרכבות החיוניות של חומר הריבוי המאולח שטופל בתכשירי ההדברה לא היה שונה במובהק מזה של חומר הריבוי הבריא )איור מספר 6(. איור מספר 5. השפעת עוצמת הקרינה והטמפרטורה על הישרדות של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה בקטעי גזם מאוכלסים שנלקחו מחלקת האבוקדו במח"ע. א. הישרדות הפטריות בקטעי גזם מרוסקים שנחשפו לקרינת שמש ישירה במשך כל תקופת הניסוי; ב. השפעת עוצמת הקרינה על ההישרדות: 100% קרינה חשיפה לקרינת שמש ישירה; 30% קרינה = עוצמת הקרינה מתחת לרשת צל של 70%. שכיחות קטעי הגזם שהיו מאוכלסים בפטריות בטיפול שלידו יש כוכב שחור שונים במובהק מאילו של הטיפול בו קטעי הגזם היו חשופים לקרינת השמש הישירה )מסומן בחץ שחור(. ג. השפעת הטמפרטורה על ההישרדות: החישוב של שעות המעלה חושב מעל סף של 0 מעלות צלזיוס. קו הרגרסיה חושב עבור נתוני שני הטיפולים. איור מספר 6. השפעת הפטריות LT ו LPT על הצלחת ההרכבה והתרומה של חיטוי חומר הריבוי המאולח למשך 5 דקות בתמיסה מימית של סוויץ )0.1%( ודלסן )0.1%(. עמודות שחורות היקש; עמודות ירוקות חיטוי בתכשירי הדברה. ערכי עמודות שלידן כוכבים בצבע שחור שונים במובהק מערכי עמודת ההיקש שלא אולחה וערכי עמודות שלידן כוכב בצבע ירוק שונים במובהק מהערכים של העמודות הסמוכות אליהן. 2 ההבדלים נקבעו במבחן X ברמת מובהקות של < P

14 4.1.3 מיון קפדני של השתילים במשתלה לפני המכירה מאחר והתברר ששתילים המיוצרים במשתלה עשויים להיות מאוכלסים בגורם המחלה, גם אם לא נראים עליהם כל תסמיני מחלה, הומלץ לשתלנים ולנוטעים לבחון בקפדנות את השתילים לפני העברתם לחלקות הגידול. התסמין הוויזואלי אותו יש לבחון הוא הפרשה של פרסיטול באזור ההרכבה. פרסיטול הוא סוכר המופרש על ידי עצי אבוקדו במקרים בהם הם נחשפים לעקה, כמו נגיעות בבוטריוספריה. אבל, הפרסיטול מופרש גם בעצים שנחשפו לגורמי עקה אחרים. בחלק מהמקרים חיתוך של הקליפה באזור ההרכבה מאפשר אכן לראות החמה באזור העיצה של השתילים המצביעה על נגיעות במחלה )איור מספר 7(. חשוב לציין שלא הצלחנו לבודד את גורם המחלה מאזור ההרכבה של כל השתילים שהייתה עליהם הפרשה של פרסיטול. כך למשל, בודדנו את גורם המחלה מ 7 מתוך 43 שתילים ההרכבה )16.3%( שנפסלו על ידי משתלה אחת בגלל הפרשה של פרסיטול באזור ומ 2 מתוך 9 שתילים )22.2%( שנפסלו על ידי משתלה אחרת. לא ברור מה היה הגורם להפרשה של הפרסיטול ובאם הוא קשור לנגיעות השתילים בגורם המחלה או לא. בכל מקרה, ההקפדה שלא לטעת שתילים שיש עליהם הפרשה של פרסיטול מפחיתה את הסבירות ששתילים המאוכלסים בפטריות יגיעו למטעים. איור מספר 7. א. שתילים המוכנים לשיווק במשתלה; ב. צילום תקריב של שתיל בו יש הפרשה של פרסיטול באזור ההרכבה )מסומן בעיגול לבן(; ג. תסמיני החמה באזור ההרכבה של שתיל שהייתה בו הפרשה של סורביטול באזור ההרכבה. 4.2 פיתוח גישות למניעת תמותה של עצים בנטיעות צעירות השריית עמידות באמצעות התכשיר קנון בנטיעות שכיחות השתילים שמתו אחרי תחילת הניסויים בחלקות ההיקש של הניסויים נע בין 6% )בניסוי שהיה בלהבות חביבה( ל 31% )בתצפית שהייתה בלהבות חביבה(. בארבע מתוך ששת הניסויים והתצפית הטיפול בקנון הפחית את שכיחות השתילים המתים במובהק יחסית לתמותה שהייתה בחלקות טיפול ההיקש. הפחתת התמותה הייתה בערכים של 50-60% לערך. לא היה הבדל ביעילות בין הריסוס וההגמעה ובניתוח כולל של הניסויים נראה היה שלריסוס היה יתרון על ההגמעה )איור מספר 8(. מנתוני מדידת קוטר הגזע עלה שהטיפול בקנון לא השפיע על קצב הגדילה של השתילים. נתונים מניסוי מייצג מופיעים באיור מספר 9. ממצאים דומים התקבלו גם בניסויים האחרים )תוצאות לא מוצגות( השריית עמידות באמצעות התכשיר קנון בנטיעות 2014 בכל הניסויים שהועמדו בנטיעות 2014 הייתה שכיחות התמותה בחלקות ההיקש נמוכה. שכיחות התמותה בהערכות שבוצעו בחודש דצמבר 2015 בחלקות ההיקש של הניסויים נעו בין 5.3 ל % בניסויים שבוצעו בכפר גליקסון ובבני ציון, בהתאמה. בכל הניסויים לא היה לטיפולי הקנון השפעה מובהקת על הפחתת התמותה )תוצאות לא מוצגות(. 14

15 איור מספר 8. השפעת טיפולי הקנון על תמותה של שתילים בששה ניסויים ותצפית אחת )להבות חביבה )חלקות 30-31( שבוצעו בחלקות אבוקדו שנשתלו בשנים 2012 ו הערכות הנגיעות בוצעו בחודשים יוני-אוגוסט הטיפולים: 1. היקש; 2. קנון בריסוס )0.5%(; 3. קנון בהגמעה )ליטר וחצי לדונם(; 4. קנון בריסוס+בהגמעה. ערכי עמודות שלידן כוכב ירוק שונים במובהק מערכי עמודת ההיקש של אותו הניסוי ברמת מובהקות של > 0.05 P. איור מספר 9. השפעת טיפולי הקנון על קצב הצימוח של שתילי אבוקדו בניסוי שבוצע במעין צבי-נחשולים. באף אחד ממועדי ההערכה לא היו הבדלים מובהקים בשטח הגזע בין הטיפולים השונים. 4.3 פיתוח גישות לשיפור המצב התברואתי של מטעי אבוקדו מבוגרים לטיפול בקנון הייתה השפעה מובהקת על בריאות העלים בחמישה מתוך שמונת הניסויים והתצפיות שבוצעו במטעים המבוגרים. בניסויים שבוצעו במטע מח"ע נטיעת 2005, במטע באייל, בנירים בזנים אטינגר והאס ובזיקים, הטיפול בקנון הפחית במידה זו-או-אחרת את השכיחות של העצים שהיו בדרגות הנגיעות הגבוהות והעלה במובהק את השכיחות של העצים עם דרגות הנגיעות הנמוכות )איור מספר 10(. אבל, מן הראוי לציין 15

16 שההשפעה, גם כשהייתה מובהקת, לא הייתה משמעותית בהכרח. גם בעצים המטופלים היו עצים עם ענפים יבשים. איור מספר 10. השפעת טיפולי הקנון על בריאות עצי אבוקדו בניסויים ותצפיות שבוצעו במטעים מבוגרים. הקנון יושם בהגמעה דרך מערכת ההשקיה של המטע במינון של 1.5 ליטר לדונם, מידי חודש וחצי עד חודשיים. עמודות שחורות טיפול ההיקש; עמודות ירוקות טיפול ההגמעה. הערכות הנגיעות בוצעו במהלך חודש דצמבר 2014 על פי סולם של 4 דרגות, כלהלן: = 0 אין על העץ ענפים יבשים; = 1 על העץ היו מעט ענפים יבשים )עד 2 ענפים בממוצע לעץ(; = 2 על העץ הייתה כמו בינונית של ענפים יבשים )3-5 ענפים בממוצע לעץ(; = 3 על העץ הייתה כמות גדולה של ענפים יבשים )יותר מ 6 ענפים בממוצע לעץ(. ערכי עמודות שלידן כוכב שונים במובהק מערכי טיפול ההיקש ברמת מובהקות של < 0.05 P. 4.4 בחינת הגורמים להתייבשות תפרחות במטעי אבוקדו מבוגרים באביב 2015 היה גל חום קיצוני בסמוך לאחר מועד הפריחה של האבוקדו. גל החום גרם לנשירה של פרחים ושל חנטים צעירים והיו מטעים בהם בחלק מהעצים מרבית התפרחות לא נשאו פרי. התסמינים על התפרחות התחלקו לשני סוגים: הסוג הראשון כלל תפרחות בהם לאחר נשירת הפרחים והחנטים השיזרות נשארו ירוקות לאורך זמן; הסוג השני כלל תפרחות בהן השיזרות השחירו ונראו עליהם תסמינים שהיו דומים לאלה המתפתחים על ענפים עשבוניים הנגועים בבוטריוספריה. עם חלוף הזמן התסמינים התקדמו מהתפרחת אל הענף הנושא אותה וגם עליו גרמו לתסמיני המחלה האופייניים )איור מספר 11(. במהלך אביב 2015 נדגמו תפרחות ירוקות ותפרחות עם תסמיני השחרה ממטעים שונים ברחבי הארץ ובכלל זה ממח"ע, יקום )שלוש חלקות(, רגבה וכפר גליקסון. הדגימות נלקחו מהזנים האס, פינקרטון, ריד והרווסט. ב 80 מתוך 236 הבידודים שבצענו מתפרחות שהיו עליהם תסמינים )33.8%( התפתחו פטריות מקבוצת הבוטריוספריה; לעומת זאת, ב 20 מתוך 135 הבידודים שבצענו מתפרחות שנראו ירוקות )14.8%( התפתחו הפטריות. כמובן שעצם הבידוד של הפטריות לא מרמז, בהכרח, שהן היו אילה שגרמו להתייבשות ולנשירת הפרחים והחנטים. כדי לאושש זאת צריך להשלים את מבחן קוך. בצדו המזרחי של קיבוץ יקום ניטעו ביולי 2014 שתי חלקות אבוקדו מהזן הרווסט. המרחק בין שתי החלקות הוא כמאה מטר. סוג הקרקע בין שתי החלקות דומה, מקור השתילים היה זהה, מועד השתילה היה זהה וממשק הגידול היה זהה. ההבדל היחיד בין שתי החלקות היה סוג מי ההשקיה. בעוד שחלקה אחת הושקתה במים מושבים החלקה השנייה הושקתה במים שפירים )מפני שבסמוך לחלקה קיימת באר ולא ניתן היה להשקות שם במים מושבים(. באביב 2015 החלקות היו מפותחות יפה ביחס לגילן ושתי החלקות פרחו פריחה שופעת. לאחר גל החום שהיה נשרו כל הפרחים והחנטים. בהמשך ניכר הבדל משמעותי בין שתי החלקות: בעוד שבחלקה שהושקתה במים שפירים התפרחות הפגועות נשרו והתפתח גל צימוח חדש, בחלקה שהושקתה 16

17 במים מושבים התפרחות נשארו מחוברות, הן השחירו ותסמיני התייבשות התקדמו לענף שנשא אותן. מעבר לכך, ההתפתחות התקינה של העצים הואטה )איור מספר 12(. עם חלוף הזמן העצים בחלקה שהושקתה במים מושבים התאוששו, ובקיץ 2015 כבר הבדלים בבריאות העצים בין החלקות כבר לא היו ניכרים. איור מספר 11. מצבי פגיעה שונים בתפרחות ממקומות שונים בארץ ובזינם שונים. א. עץ בו מרבית הפרחים והחנטים נשרו וכמות היבול שלו פחתה משמעותית. ב. תפרחת ממנה נשרו כל הפרחים והחנטים אבל השזרות נשארו ירוקות וחיוניות; ג. תפרחת ממנה נשרו כל הפרחים והחנטים ועל השיזרות התפתחו תסמינים הדומים לאילו הנגרמים על ידי פטריות הבוטריוספריה; ד. תפרחת יבשה שתסמיני המחלה האופייניים עברו לענף הנושא את התפרחת )מסומן בחץ שחור(. איור מספר 12. צילום של שתילים מייצגים ממטעי האבוקדו ביקום. א. שתיל שהושקה במים שפירים; התפרחות הפגועות נשרו והצימוח היה תקין. ב. שתיל שהושקה במים מושבים; התפרחות הפגועות השחירו ונותרו מחוברות לשתיל. בחלק מהענפים תסמיני ההתייבשות התקדמו לענפים )מסומן בחיצים שחורים(. ההתפתחות התקינה של השתיל הואטה משמעותית. 17

18 4.4.1 השפעת סוג הכנה על התייבשות תפרחות התברר שקיימת השפעה למצב הפיזיולוגי של העצים, המתבטא בפוטנציאל עומס היבול ובצבע העלים לשכיחות ההופעה של תסמני התייבשות בתפרחות. מתיאור התוצאות המופיעות באיור מספר 13 ניתן להסיק את המסקנות הבאות: בכל הכנות, פוטנציאל היבול היה גבוה יותר בעצים שהעלווה שלהם הייתה בצבע ירוק כהה מאשר בעצים שצבע העלווה שלהם היה ירוק בהיר; בלי תלות בצבע העלווה של העצים, קיים מתאם הפוך בין פוטנציאל עומס היבול להופעת תסמיני התייבשות בתפרחות: ככל ששכיחות העצים עם פוטנציאל יבול גבוה הייתה רבה יותר, כך הייתה שכיחות העצים עם דרגות התייבשות 2+3 נמוכה יותר )יש נקודה אחת חריגה VC-28 צבע כהה; מסומנת בכוכבית(; בלי תלות בצבע העלווה של העצים, פוטנציאל היבול של הכנות VC302 ו VC-51 היה גבוה יותר מזה של הכנות האחרות, ושכיחות העצים של כנות אלה שהם היו דרגות התייבשות 2+3 הייתה נמוכה יותר. איור מספר 13. ממצאי ניסוי הכנות של דר' ליאו וינר בו נבחנת ההתאמה של כנות שונות לגידול באזור השרון. בכל הכנות הזן הוא האס. הסבר על המדדים השונים מופיע בטקסט. הסימן שלידו כוכבית הוגדר כערך חריג וקו הרגרסיה חושב בלעדיו סניטציה של רקמות צמחיות סימפטומטיות בחלקת ריד בקיבוץ יקום בזמן העמדת הניסוי בחלקה ביקום כל העצים שנכללו בו היו בדרגת נגיעות 2 או יותר )נגיעות בינונית ומעלה(. הצלחנו לבודד פטריות מקבוצת הבוטריוספריה מ 94.1% מהענפונים הירוקים החד-שנתיים שנדגמו. לאחר ביצוע פעולות הסניטציה כל העצים בטיפול הסניטציה סווגו לדרגה 0 )מאחר ולא נראו עליהם ענפים יבשים(. במהלך הזמן שעבר מאז התפתח צימוח צעיר, ירוק בחלק מעצי טיפול ההיקש ונראה היה לכאורה שחומרת המחלה שלהם פחתה. למרות זאת, כחצי שנה אחרי הטיפול, בחודש פברואר 2016 הנגיעות של כל עצי טיפול ההיקש סווגו לדרגה 2 או יותר. לעומת זאת, כל העצים בהם בוצעה סניטציה שמרו על הבריאות שלהם ולא נראתה בהם כל התייבשות )איור מספר 14(. בדגימה של ענפונים עשבוניים חד-שנתיים שנלקחה בחודש אוקטובר 2015 הצלחנו לבודד פטריות מקבוצת הבוטריוספריה מ 28.6% מקטעי הענפים העשבוניים שנדגמו מעצי ההיקש אבל רק מ 14.3% מהענפונים שנדגמו מהעצים שעברו סניטציה. בבידודים שבוצעו בחודש פברואר 2016 השכיחות הייתה 77.1 ו % בשני הטיפולים, בהתאמה. 5. דיון היעד של מיזם חוס"ן בוטריוספריה, כפי שהוגדר על ידי וועדת ההיגוי לפני תחילת המיזם היה "פיתוח גישות ליצור חומר ריבוי נקי ולהתמודדות עם נגיעות קיימת בשתילים צעירים ממחלות הנגרמות על ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה באבוקדו, אפרסק ונקטרינה". בנוגע לאבוקדו, המטרות הספציפיות שנקבעו על ידי החוקרים המעורבים והוועדה המקצועית היו: 1. לאפיין את מקורות המידבק הראשוני העיקריים של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה המנגעות עצי אבוקדו; 2. לפתח גישות ליצור חומר ריבוי של אבוקדו הנקי ממחלות הנגרמות על ידי פטריות מקבוצת הבוטריוספריה; ו 3. לפתח גישות להתמודדות עם מחלת הבוטריוספריה בנטיעות 18

19 צעירות. במהלך שנת המיזם השנייה ענינו על כל המטרות והישגנו, למעשה, את היעד של המיזם. לגבי מטרות מספר 1 ו - 2, הראינו שמקור המידבק הראשוני העיקרי הוא מעצי האם מהם נלקח חומר ריבוי שנראה לכאורה בריא, אך היה למעשה מאוכלס בגורם המחלה. בהסתמך על הממצאים שעלו במיזם השירותים להגנת הצומח יחד עם שירות ההדרכה והמקצוע ושולחן האבוקדו במועצת הצמחים עשו מהפך בנושא השתלנות באבוקדו. הוגדרו מטעים המיועדים בלעדית עבור חומר ריבוי, פותח פרוטוקול לטיפול במטעים הללו )ראה נספח מספר 1(, הוגדר פרוטוקול לייצור שתילים במשתלות )ראה נספח מספר 2( וחודדו ההמלצות למגדלים הרוכשים שתילים מהמשתלות. הממצאים יושמו באופן מידי בשטח והתוצאות מדברות בעד עצמן: בעוד שבשנים הפחת במשתלות עמד על 20% מהייצור לערך, משנת 2014 ואילך הפחת במשתלות הוא אחוזים בודדים מהייצור. בעוד שבנטיעות מתו בין 20 ל 30% מהשתילים הצעירים, החל משנת 2014 שכיחות התמותה ירדה לערכים של 4-6% מהשתילים, שכיחות התואמת את המקובל בענף. אבל, אסור לקפוא על השמרים ויש להמשיך ולפעול בנושא באופן רציף. בדו"ח זה הראינו שגורם המחלה אכן מאכסן ענפונים חד-שנתיים עשבוניים שלא מראים תסמינים )איור מספר 3(; הראינו שגורם המחלה מסוגל לשרוד ברסק גזם נגוע למשך תקופות ארוכות ושקשה, עד בלתי אפשרי, לטפל ברסק הגזם )איור מספר 5(. המשמעות היא שצריך להקפיד ליישם את הפרוטוקולים לטיפול במטעי האם ולייצור חומר הריבוי במשתלות. בגלל האופי האנושי לא-מן-הנמנע שלאחר מספר שנים שבהן המחלה תהיה בשליטה ושלא יגרם נזק, יתקבל הרושם שלא קיימת עוד בעיה והמשמעת של העוסקים בנושא תתרופף. אם כך יהיה, המחלה עלולה לחזור ולהתפרץ ולגרום לנזקים כפי שהיה בשנים 2012 ו זו מחויבות של העוסקים והמובילים את ענף האבוקדו לשמור על כל המערכת בתפקוד מלא, כפי שהיא היום. איור מספר 14. תמונות של עצים מייצגים מהניסוי שהוצב בקיבוץ יקום לבחינת ההשפעה של טיפולי סניטציה על בריאות העצים. תמונות א' ו ב' צולמו בחודש אוגוסט 2015 לפני העמדת הניסוי: א. עץ נגוע לפני הגיזום בדרגת נגיעות 4 )החמורה ביותר(; ב. עץ נגוע לפני הגיזום בדרגת נגיעות 2 )נגיעות בינונית(. תמונות ג' ו ד' צולמו בחודש פברואר ג. עץ שהיה בדרגת נגיעות 4 בזמן העמדת הניסוי ולא נגזם טיפול ההיקש; ד. עץ שהיה בדרגת נגיעות 4 בזמן העמדת הניסוי ונגזם טיפול הסניטציה. 19

20 לגבי מטרה מספר 3 בחנו את היעילות של השימוש בתכשיר קנון להשריית עמידות. התכשיר אינו תכשיר הדברה ולכן הציפיות ממנו לא היו גבוהות. למרות זאת, השימוש בו הפחית את התמותה של שתילים שניטעו כשהם מאוכלסים בגורם המחלה. בעקבות הממצאים המליצו המדריכים לטפל בקנון בכל מטעי האבוקדו עד שנתיים לאחר הנטיעה. למיטב ידיעתנו מרבית המגדלים מיישמים המלצה זו כלשונה והרושם המתקבל הוא שהטיפול יעיל. מאחר שמשנת 2014 נעשה שימוש בחומר ריבוי חדש, שבריאותו משופרת יחסית לחומר הריבוי בו נעשה שימוש בשנים , לא הצלחנו להדגים בניסויים החדשים שהצבנו את התרומה של הטיפול בקנון מפני ששכיחות השתילים המתים הייתה נמוכה ממילא. בכל מקרה, חשוב לזכור שהקנון לא מרפא את העצים הפגועים. הוא מאפשר להם להתמודד עם גורם המחלה בצורה טובה יותר ולשרוד את השנתיים הראשונות, הקריטיות. הבעיה היא שבשתילים המאולחים שטופלו בקנון גורם המחלה ממשיך לקנן בתוך הריקמה הצמחית ועלול להתפרץ בעתיד. אין אנו יודעים אם כך יקרה או לא, אך אפשרות זו קיימת וחשוב להיות מודעים לה. מאחר וחוקרי האבוקדו השלימו את היעד שהוגדר להם על ידי וועדת ההיגוי של המיזם, הוטל עליהם להפנות משאבי מחקר גם לפגיעה אותה גורמת המחלה לעצים מבוגרים. נושא זה הוגדר בזמנו כבעל עדיפות שנייה למחקר. התחלנו לעשות זאת בשנת המיזם השנייה ואנו מתכוונים להתמקד בנושאים הקשורים לעצים המבוגרים בשנה השלישית של המיזם. למיטב שיפוטנו התסמין המרכזי בו יש להתמקד הוא הפגיעה בפרחים, בתפרחות ובחנטים. כפי שצוין בפרק התוצאות הצלחנו לבודד את גורם המחלה מתפרחות סימפטומטיות יבשות אבל זו )כמובן( אינה הוכחה לכך שהפטריות גרמו להתייבשות השיזרות ולהפלה של הפרחים והחנטים. בשנת המיזם השלישית ננסה להשלים את מבחן קוך ונשאף להבין מתי ואיך נדבקו התפרחות בגורם המחלה. חשוב לבחון נושא זה כי אם יתברר שאכן פטריות מקבוצת הבוטריוספריה פוגעות בתפרחות, בפריחה ובחנטה, הרי שיש לכך השפעה מידית וישירה על היבול. על פי הידוע נבגים של פטריות המתפתחים בתוך פיקנידיות )פיקנידיוספורות( מופצים למרחב בזמן ירידת גשמים בנתזי טיפות הגשם הפוגעים בגופי הפרי של הפטרייה. חלק מהממצאים שעלו מהמחקר שבצענו עד כה אינם תואמים מקובלה זו. למשל, התברר שענפונים עשבוניים חד-שנתיים מאוכלסים בגורם המחלה במשך כל השנה )איור מספר 3( ולא רק בתקופת החורף. לא ברור איך נדבקו הענפונים בתקופות בהן לא ירדו גשמים. גם העובדה שתפרחות נוגעו במטעים אחרי אירוע שרב בחודש מאי )בתקופה יבשה( לא מתאימה להנחה שהפצת הנבגים מתרחשת רק בגשם. הממצאים המצביעים על כך שקיימים הבדלים בעוצמת הפגיעה בפרחים ובהתייבשות התפרחות בעצים שהושקו במים באיכויות שונות )איור מספר 12( ובעצים שגדלו על כנות שונות )איור מספר 13(, מרמזים על מעורבות של גורמים פיזיולוגיים בהופעת התסמינים בתפרחות. אם אכן יתברר שפטריות מקבוצת הבוטריוספריה פוגעות בתפרחות ובחנטה, חשוב יהיה לפתח אמצעים להגן על הפרחים בפני הדבקה. כבר התחלנו בגישושים ראשונים לבחינת האמצעים האפשריים והצבנו ניסוי גיזום ביקום, בחלקה נגועה מאד. הניסוי נמצא בשלביו הראשונים ואנו מתכוונים להמשיך אותו בשנת בהמשך נבחן את היעילות של תכשירי הדברה שייושמו בתקופת הפריחה על הינגעות פרחים ועל החנטה. אנו מצפים שבמהלך השנה השלישית של המיזם נוכל להגיע לתובנות לגבי מעורבות פטריות מקבוצת הבוטריוספריה בהתייבשויות של תפרחות ולגבי היעילות של אמצעים שונים להתמודד עם הבעיה. 6. הבעת תודה אנו מודים לכל המעורבים במחקר ובישום הממצאים- אנשי שרות הדרכה והמקצוע )מיקי נוי, הדר כהן, עמי קינן, ליאו וינר, אלי קלוסקי ואודי גפני(, אנשי מועצת הצמחים )משה ברוקנטל, רני בר-נס(, וכל המגדלים שאפשרו לנו לבצע את הניסויים במטעים שלהם ותרמו מזמנם וממרצם; תקצר היריעה לפרט כאן את השמות של כולם. אנו מודים לגורמים המממנים את המיזם: קרן המדען הראשי של משרד החקלאות ומועצת הצמחים )שולחן אבוקדו(. 20

21 פרק 2: בחינה )ברמת הצמח השלם( של יחסי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי דו"ח לשנת המחקר השנייה המוגש לוועדת ההיגוי של מיזם חוס"ן בוטריוספריה ע"י סטנלי פרימן ומרסל מימון מחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר עשבים, מנהל המחקר החקלאי, בית דגן תקציר 1. בספרות המקצועית דווח שפטריות מקבוצת הבוטריוספריה חודרות לרקמות צמחיות דרך פצעים. מיקום הפטרייה ברקמות הנגועות יבחן בעזרת שימוש בפטרייה מהונדסת גנטית ל- GFP )חלבון פלואורסצנטי זוהר(. תבדידי L. pseudotheobromae ו - theobromae AVO 4,L. ו - 6 AVO בהתאמה, שימשו בכל הניסויים לטרנספורמציות מולקולריות של הגן המדווח.GFP כל שיטות הניסויים לטרנספורמציה באמצעות אגרובקטריום ופרוטופלאסטים לא צלחו. השתמשנו במספר שונה של פלסמידים מיושרים ומעגלים. לאור אי ההצלחה בשיטות שתוארו, ננסה בעתיד לקבל טרנספורמנטים ע"י בניית וקטור שיתאים לבוטריוספריה המכיל מקטע הומולוגי, שמקורו ברצף גנומי אקראי של בוטריוספריה. בעבר הצלחנו לבנות מחדר בשיטה דומה שהצליח לסמן את הפטרייה קולטוטריכום. 2. מבוא בתצפיות שבצענו באבוקדו נראה שהפתוגנים חודרים לענפים הרב-שנתיים במקום החיבור של ענפים אלה עם הענפונים החד-שנתיים, ששם יש סדקים/פצעים. לאחר ההדבקה הפטרייה מתפשטת לאורך הרקמות הפנימיות של הענפים הרב שנתיים. באזורים הנגועים הרקמה הפנימית משנה את צבעה מהצבע הבהיר האופייני של רקמה בריאה לצבע חום נקרוטי. הרקמה הפגועה, הנקרוטית, היא רקמת הקסילם אך במספר מקרים נראה שגם אזור הקליפה, הפלואם, נפגע. שינוי צבע לא מרמז בהכרח על המקום בו נמצאת בפועל הפטרייה מפני שיתכן שהתפטיר נמצא הרבה מעבר למקום בו נראים תסמיני הנקרוזה. לחילופין יתכן שהנקרוזות מתפתחות במקומות מרוחקים ממקום הימצאות התפטיר. חשוב לדעת היכן נמצאת הפטרייה בפועל כי מידע זה חיוני לביצוע פעולות סניטציה. בנוסף, מידע זה ירמז על המנגנון בו פוגעת הפטרייה ברקמות הצמחיות. כמוכן, השימוש בתבדיד מסומן יאפשר לנו לבחון את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן, כגון יצירת נבגים אל מיניים ותפקידם בפיזור המחלה. מיקום הפטרייה ברקמות הנגועות יבחן בעזרת שימוש בפטרייה מהונדסת גנטית ל- GFP )חלבון פלואורסצנטי זוהר(. פלסמיד המכיל את החלבון יוחדר לפטרייה באחד השיטות המקובלות )שיטת הפרוטופלאסטים או בעזרת אגרובקטריום-טרנספקציה( המבוצעות במעבדה של פרימן באופן רוטיני. נשתמש בפטרייה הזוהרת שתתקבל לאילוח רקמות מעוצות של שתילים. לאחר מכן יילקחו רקמות צמחיות מהשתילים הנגועים, במרחקים שונים ממקום האילוח, ממקומות סימפטומטיים וממקומות א-סימפטומטיים. דגימות אלה יבחנו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי )בו ניתן לראות את תפטיר הפטרייה הצבוע בצבע זוהר( וכך נוכל לקבוע היכן נמצא תפטיר הפטרייה בפועל. 21

22 3. תיאור הניסויים שבוצעו והממצאים תבדידי L. pseudotheobromae ו - theobromae AVO 4,L. ו - 6 AVO בהתאמה, שימשו בכל הניסויים לטרנספורמציות מולקולריות של הגן המדווח,GFP בכל הניסויים לטרנספורמציות מולקולריות. תחילה ניסינו לעשות טרנספורמציה ל - GFP באמצעות הוקטור psk1019 המצוי בחיידק אגרובקטריום מזן Eha 105. בשתי הפטריות לא התקבלו טרנספורמנטים. בהמשך ביצענו טרנספורמציות עם וקטורים שונים איתם עבדנו במעבדה: ggfp Ori ו- ggfpca8 המכילים את הגן GFP וכן ptimer DsRED המכיל גן המקודד לגן RFP הזורח באדום. בטרנספורמציות אלה נעשה עיכול של תפטיר הפטריות לקבלת פרוטופלסטים והפלסמידים המעגליים הוחדרו בעזרת.PEG תהליך העיכול עבד מצוין וכך גם הרגנרציה של הפרוטופלסטים אך למרות זאת לא התקבלו טרנספורמנטים זורחים. מאחר והטרנספורמציות עם אגרובקטריום מזן Eha 105 לא הצליחו, העברנו את הווקטור psk1019 לחיידק אגרובקטריום מזן.AGL 1 חיידק זה אגרסיבי יותר ובעל יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר. גם בשילוב הזה לא קיבלנו טרנספורמנטים. בהמשך ניסינו לעשות טרנספורמציות עם וקטורים חדשים ל - :GFP pcpxhy1 egfp שהתקבל מספרד ו - pct74 sgfp שהתקבל ממדינת אורוגון, ארה"ב. הטרנספורמציה נעשתה לפרוטופלסטים עם פלסמיד מעגלי. כדי לנסות להעלות את יעילות הטרנספורמציה נעשו במקביל גם טרנספורמציות עם פלסמיד מיושר. גם בטרנספורמציות אלו לא התקבלו טרנספורמנטים חיוביים, בחלק מהקורים נראה חלבון זורח שעבר דגרדציה אך לא היה ביטוי קבוע ויציב בכל התאים. לאחרונה קיבלנו קונסטרקט GFP חדש המותאם לאגרובקטריום. הוקטור,, pcbct sgfp הוחדר לחיידקי אגרו AGL 1 ושוב ניסינו לעשות טרנספורמציות. גם בווקטור הזה לא עלה בידינו לקבל פטריה מסומנת. 5. דיון לאור אי ההצלחה בשיטות שתוארו, ננסה בעתיד לקבל טרנספורמנטים ע"י בניית וקטור שיתאים לבוטריוספריה בצורה טובה יותר. ננסה להגביר את סיכויי הצלחת הטרנספורמציות באמצעות אינטגרציה הומולוגית, זאת ע"י חיבור מקטע הומולוגי של הפטרייה לגנים ל GFP- ולהיגרומיצין שבווקטור. המקטע ההומולוגי, שמקורו ברצף גנומי אקראי של בוטריוספריה, יושג מריצוף מקטעים שיתקבלו מראקציות appcr והריצופים שיתקבלו יושוו למאגרי המידע כדי לוודא שאינם רצפים המקודדים לחלבון. 22

23 פרק 3: חקר מנגנון השראת עמידות באבוקדו באמצעות ריסוס של החומר "קנון" דו"ח לשנת המחקר השנייה המוגש לוועדת ההיגוי של מיזם חוס"ן בוטריוספריה ע"י ורד יריחימוביץ, אייל הלון המחלקה למדעי עצי הפרי, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן עדי פייגנבוים המכון למדעי הצמח, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן דני שטיינברג, סטנלי פרימן המחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר העשבים, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן 1. תקציר הצגת הבעיה: במסגרת מיזם חוס"ן בוטריוספריה נמצא שטיפול ע"י ריסוס בתכשיר "קנון", המכיל את החומר הפעיל חומצה זרחיתית, הפחית באופן מובהק תמותת שתילי אבוקדו נגועים בפטריות מהמין.Botryosphaeria באופן מפתיע, במבחני רעילות של התכשיר כנגד הפטרייה בצלחות פטרי, לא נמצא עיכוב גידול התפטיר. מהספרות, ידוע כי חומרים כגון פוסיפיט עשויים להשרות בצמחים מנגנון "פרימינג". מנגנון זה מוביל לתגובה ראשונית קלה, שעשויה להיות מלווה בשעתוק של גנים ספציפיים ממערכת ה )SAR( Systemic Acquired Resistance ו/או ה- Induced Systemic.)ISR) Resistance לאחר מכן, בעת התקפת הפתוגן, מתרחשת בצמח תגובה שניונית המסוגלת לבלום את התפשטות המחלה. מטרת המחקר: בעקבות המידע המוצג לעיל הועלתה היפותזות העבודה הטוענת כי באבוקדו תכשיר ה"קנון" עשוי באופן עקיף להקנות עמידות לפטריות מהמין Botryosphaeria ו/או לפתוגנים נוספים ע"י הפעלת מנגנון "פרימינג". היעד המרכזי של המחקר הנוכחי היה לאפיין את מנגנון השראת העמידות המופעלת ע"י קנון באבוקדו, כאשר מטרות המחקר הספציפיות שהוגדרו היו: 1. לאפיין את מערך הגנים המשופעלים לאחר הטיפול. 2. לבחון את קינטיקת הביטוי של גנים ספציפיים לאחר טיפול. ו- 3. לבחון האם יש צורך בטיפול נוסף להמשיך את השיפעול. שיטות עבודה תוצאות ומסקנות: בשנת המחקר זו עסקנו בנושאים 1 ו- 2. ביצענו ניסויים בשתילי אבוקדו 'האס' שטופלו ע"י ריסוס בתכשיר "קנון" במספר מועדים. רנ"א שהופק מעלים של שתילי ביקורת ומשתילים מטופלים שימש לאנליזות ביטוי. ע"פ תוצאות RT-PCR שקיבלנו נראה כי טיפול "קנון" משרה באבוקדו מנגנון "פרימינג" שהודגם בעלייה זמנית בביטוי גנים המקודדים לחלבוני (PRs( Pathogenesis related proteins ובירידה ברמת התעתיק של הבקר השלילי של מנגנון ה-.PaNPR4,SAR בנוסף, תוצאות אנליזת RNA-Seq הראו כי טיפול קנון משרה שינוי מהותי ברמת הטרנסקריפטום. תוצאות אלו התקבלו במהלך החודש האחרון. כעת, בכוונתנו לבדוק באופן מפורט, ע"י מבחני העשרה של,GO annotation את תוצאות הטרנסקריפטום. אנו מקווים כי מחקר מעמיק יותר יאפשר לקבל תובנות רחבות יותר באשר לאופן בו "קנון" משרה עמידות בשתילי אבוקדו. תובנות אלו עשויות לא רק לתרום להבנה מעמיקה של הנושא אלא לתרום בגיבוש פרוטוקול יעיל יותר לטיפול בתכשיר קנון בשתילי אבוקדו. 23

24 2. מבוא שימוש בתכשיר המסחרי "קנון" באבוקדו. התכשיר המסחרי "קנון" )המכיל את החומר הפעיל חומצה זרחיתית H(, 3 PO 3 מוכר זה שנים כתכשיר המשמש לצורך הדברת אורגניזמים ממערכת ה- Oomycota )פטריות לא אמתיות כגון )Phytophthora cinammomi בעצי אבוקדו נגועים )2008.)Perez-Jimenez, במקרה זה, פעילות התכשיר נובעת בעיקר מפעילות ישירה כנגד גופי ריבוי וכנגד תפטיר הפטרייה. בניסויים שבוצעו במסגרת מיזם חוס"ן Botryosphaeria נמצא שטיפול ע"י ריסוס בתכשיר "קנון" הפחית באופן מובהק תמותת שתילי אבוקדו נגועים בפטריות מהמין.Botryosphaeria באופן מפתיע, במבחני רעילות של התכשיר כנגד הפטרייה בצלחות פטרי, לא נמצא עיכוב גידול התפטיר עד ריכוזים של 1000 ח"מ. ממצא זה מצביע על האפשרות שתכשיר "קנון" עשוי להקנות עמידות לפטריות מהמין Botryosphaeria לא ע"י פעילות ישירה כנגד הפטרייה כי אם ע"י שפעול מנגנוני הגנה טבעיים של הצמח. מנגנוני ההגנה הטבעית של הצמח. ככלל, מנגנוני ההגנה הטבעיים בצמחים נחלקים לשני סוגי תגובות. תגובת הגנה מקומית, במקום פגיעת הפתוגן, הגורמת להגבלת או מניעת חדירת הפתוגן ותגובה סיסטמית, באזורים המרוחקים ממקום הפגיעה, המביאה לשיפור יכולת הצמח להתמודד עם הפתוגן. מנגנוני הגנה מקומיים - מנגנון ההגנה המקומית המכונה תגובת רגישות יתר HR(,)Hypersensitive Response מתאפיין בהופעת כתמים נרקוטיים במקום חדירת הפתוגן. תגובה זו דורשת לעיתים היכרות של גן של הפתוגן,(avr( המשמש כמשרן, עם גן לעמידות של הצמח gene-r),(resistance המשמש ככל הנראה כקולטן. היכרות זו מאתחלת שרשרת של אירועים הגוררת מספר תופעת פיזיולוגיות ביניהן זירחון חלבונים וייצור חמצן פעיל.) Torres et al. 2006; Heath, 2000( הדרושים להפעלת ה- HR )Reactive Oxygen Species -ROS( מנגנוני הגנה סיסטמיים - דרך נוספת בה מתמודד הצמח עם פתוגנים הינה הפעלת מנגנוני הגנה סיסטמיים המופעלים בעקבות תמותת תאים או בעקבות תגובת ה- HR. ניתן להבחין בשני מנגנוני הגנה סיסטמיים: מערכת הגנה המכונה עמידות סיסטמית נרכשת SAR(,)Systemic Acquired Resistance - הפועלת בעיקר כנגד פתוגנים ביוטרופיים ומערכת הגנה המכונה עמידות סיסטמית מושרית ISR) Induced -.)Walters et al., )2013 הפועלת ביעילות בעיקר נגד פתוגנים נקרוטרופיים,)Systemic Resistance בעוד מערכת ה- SAR מעוררת ע"י חומצה סליצילית,)SA( מערכת ה- ISR, אינה תלויה ב- SA ומקובל להניח כי מנגנון הגנה זה מעורר ע"י חומצה ג'סמונית )JA( ואתילן. שתי המערכות מתאפיינות בהקניית עמידות לטווח רחב של פתוגנים ע"י אינדוקצית גנים המקודדים לחלבונים האחראים לתגובות הגנה ועקה. בפרט, הפעלת מערכת ה- SAR מלווה בעלייה בביטוי גנים המקודדים לחלבוני Pathogenesis related ( PR.)Qing Fu and Dong, )2013 )proteins חלבונים אלו הינם בעלי פעילות שונות וביניהם ניתן למנות את קבוצת חלבוני הכיטינאזות,)PR3-4( הפועלים כנגד כיטין המצוי בדופן תאי הפטריות, קבוצת חלבוני האנדוגלוקאנזות,)PR2( המשמשים לפרוק גלוקן )פולימר של גלוקוז המצוי בין היתר בצמחים ופטריות(, קבוצת חלבוני (TLPs or PR-5( Thaumatin- like proteins המתאפיינים בקשת רחבה של פעילות אנטי- פטרייתית, וקבוצות חלבונים שתפקידן הביוכימי טרם זוהה )כגון.)Sels et al., )2008 )PR1 מנגנון ה"פרימינג": תופעה אידאלית להתגוננות כנגד פתוגניים הינה תופעה המכונה "פרימינג". תופעה זו מוגדרת כמצב בו יכולתו של צמח להתגונן מוגברת באופן המאפשר לו תגובת הגנה מהירה ויעילה ( Conrath, al., ;(. Conrath et במצב זה, סיגנל חיצוני )משרן( המכין את הצמח למתקפה אפשרית, מוביל לתגובה ראשונית קלה, שעשויה להיות מלווה בשעתוק של גנים ספציפיים ו/או בייצור מטבוליטים משניים בעלי תפקיד הגנתי. לאחר מכן, בעת התקפת הפתוגן, מתרחשת תגובה שניונית משמעותית המסוגלת לבלום את התפשטות המחלה )בדומה לתגובה חיסונית ביונקים(. מהספרות, ידועים מספר חומרים כימים הפועלים כמשרנים המעוררים תגובת "פרימינג". לדוגמא, נמצא כי משרן כימי הקרוי -aminobutyric ( BABA,)acid גורם ל"פרימינג" הן במסלול תלוי SA ובמסלול שאינו תלוי ב- SA.(Van der Ent et al., (2009 גם אשלגן זרחיתי KPhi( )Potassium Phosphite הינו חומר כימי הפועל כמשרן. בהתאם, בעבודות שנערכו בתפ"א הוכח כי טיפול מקדים ב- KPhi השרה תגובת "פרימינג" שאפשרה התמודדות יעילה בתגובה להדבקה 24

25 עם Phytophthora infestans (פטריה ממערכת ה- Oomycota הגורמת למחלת כימשון בתפו"א(. בהמשך דווח כי טיפול ב- KPhi הגביר בן היתר את ביטויים של שני גנים StNPR1 ו- StWRKY המקודדים לבקרי שעתוק המופעלים ע"י,SA והגביר יצירת קלוז, פוליסכריד המקנה תמיכה לדופן תאים צמחיים )2012 al.,.)machinandiarena et בנוסף, בעבודה עדכנית שפורסמה לא מכבר דווח כי טיפול בפוספיט בתפו"א הוביל לשינוי מהותי ברמת הטרנסקריפטום החל מ- 3 ש' לאחר הטיפול )2014 al.,.)burra et גנים מאבוקדו הקשורים למנגנון ה- SAR בעבודות קודמות שבוצעו באבוקדו זוהו ואופיינו מספר גנים הקשורים להשראת מנגנון ה- SAR ; Engelbrecht and van den Berg, 2013; Backer et al., 2015( Phytophthora בעבודות אלו אופיין דגם ביטויים בעיקר לאחר הדבקה ב.)Mahomed and Berg, 2011.)Reeksting et al., )2014 )flooding( הגורמת לריקבונות שורש, ובתנאים של הצפה cinammomi בעבודות אלו דווח לדוגמא כי לאחר הדבקה בפיטופטורה נצפתה עלייה ברמת הביטוי של PaRR5 בשורשי שתילי אבוקדו. כמו כן דווח על עלייה ברמת ביטויים שלהגנים PaNPR3,PaNPR2 המקודדים לבקרי שעתוק של תגובת,SA ושל תעתיק PaPR1 בשורשי שתילי אבוקדו שהודבקו בפטרייה ו/או שטופלו ב- SA.)Backer et al., 2015( יעדי המחקר: בהתבסס על התוצאות שהתקבלו לאחר טיפול בתכשיר "קנון" בשתילי אבוקדו נגועים ב-,Botryosphaeria ובתוצאות מבחני הרעילות של התכשיר כנגד הפטרייה בצלחות פטרי, הועלתה היפותזות העבודה הטוענת כי גם באבוקדו תכשיר ה"קנון" עשוי באופן עקיף להקנות עמידות לפטריות מהמין Botryosphaeria ו/או לפתוגנים נוספים ע"י הפעלת מנגנון "פרימינג". היעד המרכזי של המחקר הנוכחי שהוגדר היה לאפיין את מנגנון השראת העמידות המופעלת ע"י קנון באבוקדו, כאשר מטרות המחקר הספציפיות שהוגדרו היו: 1. לאפיין את מערך הגנים המשופעלים לאחר הטיפול. 2. לבחון את קינטיקת הביטוי של גנים ספציפיים לאחר טיפול. ו- 3. לבחון האם יש צורך בטיפול נוסף להמשיך את השיפעול. בשנת המחקר זו עסקנו בנושאים 1 ו תיאור הניסויים שבוצעו 3.1 חומר צמחי מערכת הניסוי כללה 30 שתילי 'האס' מורכבים על כנות זריעה )דגניה 117(. שתילים אלו גודלו בעציצים במתקן בית רשת בבית דגן. 15 שתילים טופלו בתכשיר קנון- 50 )0.3% בריסוס( במועדים שונים ע"י נציג חברת לוקסמבורג )ראה טבלה 1(. 15 שתילים נוספים, לא טופלו בקנון )שימשו כטיפול ביקורת(. לאחר ביצוע הטיפולים במועד א'-ג' נדגמו מ- 2 קבוצות השתילים )טיפול וביקורת( מספר עלים במספר נקודות זמן. בכל נקודת זמן נדגם חומר צמחי מ 3-4 צמחים )4 חזרות ביולוגיות: כאשר חזרה ביולוגית = pool של חומר צמחי שנאסף מ 4 או 3 צמחים מטופלים ולא מטופלים(. במועד הרביעי נעשה שימוש ב- 15 השתילים ששימשו עד כה כשתילי ביקורת, והם חולקו כעת לשתי קבוצות: ביקורת וטיפול. במקרה זה, בכל נקודת זמן נדגם חומר צמחי מ 1-2 צמחים )3 חזרות ביולוגיות: כאשר חזרה ביולוגית = pool של חומר צמחי שנאסף מ 2 או 3 צמחים מטופלים ולא מטופלים(. 3.2 בחינת רמת ביטויים של גנים בעלי עניין בעקבות טיפול "קנון" בשלב ראשון החלטנו לבדוק את רמת הביטוי של מספר גנים המקודדים לחלבונים המשתתפים במנגנוני ההגנה השונים הפועלים בצמח. הוחלט להתמקד בגנים אלו: - PaPAL גן מאבוקדו המקודד ל.Phenylalanine ammonia-lyase זה אנזים מרכזי ביצירת פנילפרופנואודים. )ביניהם פלוינואידים ואנטוציאנינים(, הנוצרים בעיקר מחומצות האמינו הארומטיות פנילאלנין וטירוזין. ישנן דוגמאות רבות לכך שצבירה של פנילפרופנואידים בצמחים מלווה בעמידות מוגברת לעקות. חלבון ה- PAL ממלא בנוסף תפקיד ביצירת SA בצמחים במסלול תלוי Dempsey et ( Cinnamate.) Seyfferth and Tsuda, 2014; al

26 טבלה 1- פירוט הניסויים שבוצעו והשימוש שנעשה בחומר שנאסף הערות דיגום חומר צמחי מועד טיפול עלים בוגרים וצעירים רנ"א שהופק מעלים בוגרים שימש ליצירת מועד א' זמני דיגום: 72 48, 24, 0, ו- 168 ספריות שנשלחו לאנליזת RNA-seq ראה פירוט בהמשך ש' לאחר טיפול חומר זה הושמד* עלים בוגרים מועד ב' חומר זה נשמר ב 80-0 C להמשך אנליזה ** עלים בוגרים מועד ג' רנ"א שהופק מעלים בוגרים שימש לאנליזות RT-PCR ראה פירוט בהמשך**,48,24,6,0 עלים בוגרים זמני דיגום: מועד ד' 72 ו- 168 ש' לאחר טיפול * במועד זה חלה תקלה במערכת ההשקיה וחלק מהשתילים לא הושקה. התקלה נצפתה מספר ימים לאחר הריסוס. הוחלט לא להשתמש בחומר הצמחי שנדגם מניסוי זה. **ניסויים אילו לוו בדיגום חומר צמחי ששימש לאנליזות.ROS NON-EXPRESSOR OF קבוצת גנים מאבוקדו המקודדים לבקרי השעתוק מסוג - PaNRP1-4.)Backer et al. 2015( PATHOGENESIS RELATED GENES חלבונים אלו משחקים תפקיד מרכזי במערכת ה- SAR ומתחלקים לשתי קבוצות. לראשונה משתייכים NRP1 ו- NPR2 הפועלים כבקרי שעתוק חיובים. לשנייה משתייכים NRP3 ו- NPR4 המתפקדים כבקרים שליליים. לאחר עלייה ברמת SA פועל חלבון NPR1 יחד עם בקרי שעתוק נוספים ומבקר את העלייה בביטוי גני.PR1 במצבים בהם רמת SA גבוהה במיוחד, חלבוני NRP3 ו- NPR4 פועלים כבקרים שלילים, מאפשרים אוביקווטינזציה של חלבון ה- NPR1 ודגרדציה שלו במערכת הפרטאוזום. פעילות זו מאפשרת כוונון עדין של תגובת ההגנה של הצמח בתגובה לרמות שונות של.SA לפיכך, למידת תפקוד חלבונים אלו ובחינת ביטויים בתנאים שונים, חשובה להבנת פעילות מנגנוני ההגנה בצמח (2013 al..(pajerowska-mukhtar et - PaPR-5 and PaPR1 גנים מאבוקדו המקודדים לחלבוני PR1 ו-.PR5 כאמור, עלייה בביטוי גנים ממשפחה זו נמצאה בקורלציה עם השראת מנגנון ה- SAR ועם עלייה ב- SA - PaLOX גן מאבוקדו המקודד לליפואוקסיגנאז. אנזימים ממשפחה זו מקטלזים ריאקציות דיאוקסיגנציה של חומצות שומן שונות. תפקידם ההגנתי של חלבוני LOXs קשור לפעילותם בסיטנזת חומרים אנטימיקרובאלים. - PaMETAL גן מאבוקדו המקודד ל- metallothionein, אנזים פעיל בתהליך הסרת תוצרי חמצן פעילים. מבוטא ביתר כתוצאה מהדבקה בפטוגנים שונים. 3.3 אפיון כלל מערך הגנים )טרנסקריפטום( המשתנה בעקבות טיפול בקנון בכדיי לנסות ולבחון האם תכשיר הקנון מקנה עמידות ע"י שפעול דיפרנציאלי של גנים הקשורים להפעלת מנגנוני ההגנה הטבעיים של הצמח, ו/או הפעלת מסלולים אחרים, הצענו לערוך במקביל אנליזת.RNAseq אנליזה זו מתבססת על ריצוף עמוק של RNA בטכנולוגיות מתקדמות )פלטפורמת ILLUMINA-.)SOLEXSA טכנולוגיה זו מאפשרת כיסוי מעקובתי רחב של RNA המופק מדוגמאות שונות, ומאפשרת בו זמנית הן זיהוי גנים בעלי תבנית ביטוי המבדילה ביו דוגמאות, והן זיהוי גנים הנבדלים ברצף בין דוגמאות. לצורך האנליזה הופק RNA מדגימות החומר הצמחי שנאסף לאחר הריסוס ב"קנון" ב רנ"א הופק מעלים שנדגמו בנקודות זמן השונות )4 נק' זמן 3 x חזרות ביולוגיות = 12 דוגמאות(. מדוגמאות ה- RNA אלו 26

27 הוכנו ספריות cdna לריצוף עמוק ע"י שימוש בקיט TruSec RNA Samp Prep Kit FC -) (Illumina,INc איכות הספריות נבדקה ונמצאה מתאימה לביצוע אנליזת.RNAseq ריצוף הספריות בוצע ע"י ספק חיצוני )יחידת שירות ביואינפורמטי בוויצמן(, באמצעות מכשיר Illumina Hiseq 2000 בקריאות של 100 בסיסים לכל קריאה. תוצאות הריצוף עובדו מול טרנסקריפטום אבוקדו המצוי ברשותנו, ששימש כרפרנס )טרנסקריפטום זה רוצף בטכנולוגיות של 454 ו- HiSeq Illumina מתערובת RNA מרקמות עלים של הזן 'האס' - באדיבות דר' קוהן(. חלק זה של העבודה נעשה בשיתוף עם ד"ר עדי פייגנבוים מהיחידה לביואינפורמטיקה. 4. תוצאות 4.1 בחינת רמת ביטויים של גנים בעלי עניין בעקבות טיפול "קנון" בתחילת המחקר ביצענו אנליזת פרלימינריות בשיטת sq-rt-pc ובחנו את רמת ביטויים של 4 גנים נבחרים בזמן אפס )לפני הטיפול ב"קנון"( ולאחר 72 ש', בעלים משתילים מטפולים ולא מטופלים. לבדיקה זו שימש חומר צמחי שנדגם במועד תוצאות בדיקה זו הדגימו כי בפרט ניתן היה לראות עלייה בביטוי PaPR5 כ- 72 ש' לאחר הריסוס בקנון. מגמת עלייה זו לא נצפתה בתנאי ביקורת. בנק' זמן זו לא נצפה שינוי מהותי ברמת ביטויים של הגנים PaPAL,PaLOX ו- PaMETAL בעלים שרוססו ב"קנון" לעומת עלי ביקורת )איור מספר 1(. איור מספר 1: אנליזת sqrt-pcr לבחינת ביטוי הגנים PaMET,PaLOX,PaPR5 ו- PaPAL בזמן אפס )0(, 72 שעות לאחר ריסוס T-72h) ) ובתנאי ביקורת (72h C(. בוצעה אנליזה דנסיטומטרית של הבנדים שהתקבלו ורמת הביטוי נורמלה יחסית לביטוי PaACT )גן מאבוקדו המקודד לאקטין(. כל עמודה מייצגת ממוצע של שלוש חזרות + שגיאת תקן. לאחר ביצוע אנליזה ראשונית זו הוחלט להמשיך ולבדוק את דגם ביטויים של מספר גנים נבחרים בשיטת RT-PCR )בבדיקות אלו נעשה שימוש בחומר צמחי מניסוי שבוצע ב (. תוצאות אנליזה זו מוצגות באיור מספר 2. התוצאות הראו כי בפרק הזמן הנבדק רמת ביטויים של הגנים PaPAL ו- PaNRP1-3 נותרה כמעט יציבה, הן לאחר טיפול והן בתנאי ביקורת. לעומת זאת, 6 ש' לאחר טיפול נצפתה ירידה משמעותית ברמת ביטוי,PaNPR4 רמת הגן נותרה נמוכה וירדה אף יותר לאחר 48 ש'. בתנאי ביקורת רמת ביטוי PaNPR4 נותרה פחות או יותר יציבה עד 24 ש', וירדה כעבור 48 ש'. בחינת דגם הביטוי של הגנים PaPR1 ו- PaPR5 הראתה כי במקרה זה, החל מ- 6 ש' לאחר הטיפול רמת ביטויים של גנים אלו החלה לעלות, הגיעה לשיא לאחר 24 ש', וירדה לרמתם ההתחלתית לאחר 48 ש'. בתנאי ביקורת רמת ביטויים של גנים אלו נותרה נמוכה ויציבה. 4.2 אפיון רמת צורני חמצן פעיל לאחר ריסוס בקנון" 27

28 טיפולי ה"קנון" שבוצע במועד ג' ו-ד' לוו בדגימות עלים בהם אופיינו רמות ה- ROS בזמנים השונים בצמחי ביקורת וצמחים מטופלים. בחינה זו נעשתה ע"י שימוש בצבען הפלורסצנטי DCF וצילומים במיקרוסקופ פלורסצנטי. תוצאות הבחינה הראו כי בחלק מהמקרים ניתן היה לראות שינוי ויזואלי ברמת ה- 24 ROS ש' לאחר הטיפול, ובחלק מהחזרות לא נצפה שינוי כזה )ראה תמונות מייצגות איור 3(. כימות התוצאות שהתקבלו הראה שגם בצמחי הביקורת וגם בצמחים המטופלים רמת ה- ROS הייתה גבוהה יחסית 6 ש' לאחר זמן אפס, וירדה לאחר 24 ש'. מצד שני, לא נמצאו הבדלים מובהקים בין דוגמאות מטיפול "קנון" בהשוואה לדוגמאות הביקורת. תוצאות דומות הודגמו בניסוי הנוסף )לא מוצג(. 4.3 אפיון כלל מערך הגנים )טרנסקריפטום( המשתנה בעקבות טיפול בקנון" כפי שצוין לעיל, ערכנו ריצוף עמוק לדוגמאות מצמחים בזמן אפס )לפני טיפול( ובזמנים 72 48, ו- 168 ש' לאחר טיפול בקנון. )בבדיקות אלו נעשה שימשו בחומר צמחי שנדגם במועדים שונים מניסוי שבוצע ב (. חשוב לציין כי התוצאות של אנליזה זו התקבלו לידינו רק לפני חודש. בחינה ראשונית של תוצאות הריצוף העמוק הראו שדגמי הביטוי של 2,699 גנים הראו שונות מובהקת לאחר הטיפול ב"קנון". באופן כללי, ניתן היה לחלק את הגנים הללו ל- 3 קבוצות עיקריות )ראה איור מספר 4(. הקבוצה הראשונה כללה גנים שביטויים עלה באופן רציף, או זמני, בפרק הזמן הנבדק. הקבוצה השנייה כללה גנים שרמת ביטויים ירדה באופן רציף, או זמני, בפרק הזמן הנבדק, והקבוצה השלישית כללה גנים שעלייה גבוהה ברמת ביטויים הודגמה לאחר 168 ש' מזמן אפס. בחינה מקיפה ומדוקדקת יותר הראתה שע"פ דגם ביטוי הגנים שהתקבל ניתן היה לסווג את כלל הגנים ל 16 תת-קבוצות )clusters( )נספח מספר 1(. a איור מספר 2. אנליזת RT-PCR לבחינת ביטוי הגנים,PaPAL PaPR5 ו- PaPR1,PaNPR1-4 בצמחי ביקורת ובצמחים מטופלים ב"קנון". רמת ביטוי הגנים נורמלה יחסית לביטוי PaGAPDH ומוצגת בערכים של ביטוי יחסי.)RE( כל עמודה מייצגת ממוצע של שלוש חזרות ביולוגיות + שגיאת תקן לצמחים מטופלים, ושני חזרות ביולוגיות + שגיאת תקן לצמחי ביקורת. בציר ה- X מצוינים מועדי הדיגום בשעות. זמן אפס )0( מציין את נק' הזמן לפני הריסוס. חומר צמחי שנדגם במועדים שונים בניסוי שבוצע בנוב' שימש לביצוע הבדיקות )ראה טבלה מס' 1(. חשוב לציין כי התוצאות המוצגות כאן הינן תוצאות של 28

29 ROS measurements (Arbitrary Units) מיזם חוס"ן בוטריוספריה. דו"ח לשנת המחקר השנייה אנליזת Hierarchical cluster ראשונית שבוצעה. ע"מ להתחיל לפענח את התוצאות שקיבלנו בחרנו לבדוק תחילה את התוצאות הגולמיות באופן פרטני )ולא ממוחשב(, למציאת גנים ספציפיים על סמך האנוטציה שלהם. בחרנו להתמקד תחילה בבחינת דגם הביטוי של הגנים המקודדים לחלבוני NPRs,PALs ו- PRs. בדיקה זו העלתה לדוגמא כי רמת ביטוי גן המקודד לחלבון,PALb שאינו הגן שאנו בדקנו באנליזה קודמת, עלתה 48 ש' לאחר הטיפול ורמתו נותרה גבוהה עד סוף פרק הזמן הנבדק. מבין הגנים המקודדים לחלבוני ה-,NPR1-4 הודגמה שונות ברמת הביטוי של PaNPR4 בלבד, ובהתאם, 48 ש' לאחר טיפול נצפתה ירידה משמעותית ברמת ביטויו ורמתו נותרה נמוכה עד סוף פרק הזמן הנבדק. במקביל, בחינת דגם ביטויים של מספר גנים המקודדים לחלבוני PaPR3,PaPR2,PaPR1( PRs ו- PaPR5 ) הראתה כי טיפול ה"קנון" השרה עלייה מובהקת ברמת ביטויים בפרק הזמן בין ש'. לאחר מכן, ירדה רמת ביטויים בצורה חדה וחזרה לרמתם ההתחלתית כעבור 168 ש'. עלייה זמנית ומובהקת ברמת ביטויים של חמישה גני PRs נוספים הודגמה אף היא )לא מוצג(. כאמור, התוצאות המוצגות הינן על בסיס בדיקה מדגמית שביצענו. כעת, ברצוננו לבדוק באופן מפורט, ע"י מבחני העשרה של,GO annotation את מכלול התוצאות ע"מ שנוכל לשייך גנים שונים בכל תת-קבוצה למסלולים ביולוגים ופונקציות ספציפיות )עבודה זו מתבצעת בימים אלו ע"י עדי פייגנבוים(. a b a b 7 6 control c d c d 5 treatmnet 4 a b a b 3 c d c d 2 1 Time 0 24h after treatment 0 6 hr 24 hr איור מספר 3. כימות רמות ROS בעלים בצמחי ביקורת ובצמחים מטופלים ב"קנון". כימות רמות ROS בצמחים מטופלים ב"קנון" ובצמחי ביקורת )ימין(. התוצאות מייצגות ארבע חזרות ביולוגית עם שתי חזרות טכניות לדוגמא + שגיאת תקן, תמונות מייצגות של סריקת חתכי רוחב של עלי אבוקדו לאחר הדגרתם עם,DCF בזמן אפס ו- 24 ש' לאחר הטיפול ב"קנון" )שמאל(. התמונות צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי עם פילטר מסוג BA לסריקת פלורנסצית )a(, GFP פילטר מסוג IF 660 לסריקת פלורנסצית כלורופיל )b(, סריקה באור הנראה ובפילטר )c(, a וסריקה בשילוב של שני הפילטרים והאור הנראה )d(. מסומן בחץ אזור בעלה בו נראית הצטברות ROS לאחר טיפול. 5. דיון נקודת המוצא במחקר הנוכחי הייתה ההנחה כי טיפול ב"קנון" בשתילי אבוקדו עשוי להשרות מגנון פרימינג וע"י כך להקנות באופן עקיף עמידות לפטריות מהמין Botryosphaeria ו/או לפתוגנים נוספים. עבודות שנערכו בשנים האחרונות בתפו"א הוכיחו כי טיפול בפוספיט השרה תגובת "פרימינג". בפרט, נמצא כי טיפול בפוספיט הוביל לשינוי מהותי ברמת הטרנסקריפטום וכי מרבית הגנים שהגיבו לטיפול היו גנים המקודדים 29

30 לחלבוני הגנה וגנים המקודדים לחלבונים הקשורים בבניית דופן תא. עוד דווח כי כ- 40% מהגנים שהגיבו לטיפול בפוספיט הגיבו בצורה דומה לטיפול ב- BABA, אולם באופן מעניין ביטוי StPR1 עלה אך רק בתגובה ל- BABA.)Burra et al., 2014( איור מספר 4. אנליזת RNA- seq של גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי לפני ואחרי טיפול ב"קנון". אנליזת Hierarchical heatmap ו סכמת cluster המראה את דגמי הביטוי של 2,669 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי ברקמות עלים בזמן אפס )T0( ולאחר 72 48, ו- 168 ש' מטיפול ב"קנון". FDR< fold בבדיקות אלו נעשה שימשו בחומר צמחי שנדגם במועדים שונים בניסוי שבוצע ב התוצאות שהתקבלו על ידינו במחקר זה, הן באנליזת RT-PCR והן באנליזת,RNA-seq משני ניסיונות בלתי תלויים בשתילי אבוקדו העידו כי טיפול ב"קנון" גרם לעלייה זמנית בביטוי הגנים PaPR5 ו- PaPR1 30

31 בעלים. בהקשר זה, התוצאות שהתקבלו היו שונות מהשפעות טיפול ה"קנון" שדווח בתפו"א ( al., Burra et 2014(. מעניין היה לראות כי כאשר הניסוי בוצע בשתילים צעירים יותר )מועד א' טבלה 1 ואיור 5(, רמת הגנים עלתה בצורה חדה לאחר 48 ש', נותרה גבוהה לאחר 72 ש' וירדה לאחר 168 ש'. לעומת זאת כאשר הטיפול בוצע בשתילים מבוגרים יותר )מועד ד' טבלה 1 ואיור 2(, רמת ביטוי הגנים עלתה באופן חד לאחר 24 ש' וירדה לרמתה ההתחלתית כעבור 24 ש' נוספות בלבד. מממצאים אלו ניתן להסיק כי משך התגובה לטיפול זמני ויתכן שהוא מושפע מגיל השתיל. יחד עם זאת אין לשלול את האפשרות כי גם תנאים אקלימים משפיעים על משך התגובה, שכן טיפול אחד בוצע באביב )אפריל( ואחר בסתיו )נובמבר( g26927t00001 PaPALb * * * 0 hr 48 hr 72 hr 168 hr g26390t00001 PaPR-1 * * * 0 hr 48 hr 72 hr 168 hr g01574t00003 PaNPR4 * 0 hr 48 hr 72 hr 168 hr Time after treatment (h) g09877t00001 PaPR-2 * 0 hr 48 hr 72 hr 168 hr g13265t00001 PaPR-4 * איור מספר 5. תוצאות מדגמיות של אנליזת RNA-seq של גנים ספציפיים. דגם הביטוי היחסי של גנים המקודדים לחלבוני ו- PaPRs PaNPRs,PaPAL נבחרים ברקמות עלים בזמן אפס )T0( ולאחר 72,48 ו ש' מטיפול ב"קנון". * מציינת שונות מובהקת FDR<0.05 יחסית לזמן אפס hr 48 hr 72 hr 168 hr g25701t00001 PaPR * * hr 48 hr 72 hr 168 hr Time after treatment (h) מהספרות ידוע כי הצטברות,SA המלווה באינדוקציה של ביטוי גנים המקודדים לחלבוני,PRs מבוקרת באופן חיובי ע"י חלבון,NPR1 ומשחקת ככל הנראה תפקיד במנגנון ה"פרימינג" )2011 Conrath, al., 2006.)Conrath et במקרה שלנו, במידה מסוימת בניגוד לצפי, בתוצאות אנליזת ה- RT-PCR של הניסוי שבוצע בנוב', לא נצפתה השפעה חיובית כלשהי על דגם הביטוי של גני.PaNRP1-3 לעומת זאת, נמצא כי טיפול ה"קנון" השרה ירידה מהירה בביטוי PaNPR4 יחסית לזמן אפס, אם כי גם בצמחי ביקורת נצפתה ירידה מסוימת ברמת תעתיק זה. יש לציין כי גם תוצאות RNA-seq של ניסוי אפריל גם כן הראו שטיפול "קנון" השרה ירידה מובהקת ברמת תעתיק.PaNPR4 השאלה הנשאלת היא כיצד ניתן ליישב תוצאות אלו עם הידוע בספרות? בארבידופסיס, בתאים "נאיבים" )בהן רמת ה- SA נמוכה(, חלבוני NPR1 נמצאים בעיקר 31

32 בציטופלסמה וקשורים בקשרי S-S ליצירת מבנה אוליגומרי. עלייה ברמת SA גוררת לפירוק מבנה האוליגומר ולשחרור יחידות NRP1 )יצירת מונומרים(, כמו גם לעלייה ברמת שעתוק הגן המקודד לחלבון זה. לאחר כניסת מונומרים אלו לגרעין התא, נקשרים חלבונים אלו לבקרי שעתוק נוספים ומבקרים באופן חיובי את ביטוי גני.PR1 עלייה גבוהה יותר ברמת SA מפעילה לעומת זאת את חלבוני NPR3 ו- NPR4, המבקרים באופן שלילי את יציבות חלבון,NPR1 ובכך מאפשרת כיוונון עדין של התגובה ל- SA Pajerowska-( al., 2013.)Mukhtar et כאמור, התוצאות שהתקבלו בניסוים שלנו הורו כי טיפול "קנון" גרם לירידה ברמת התעתיק של אחד מהבקרים השלילים של תגובת ה- SAR,.PaNPR4 בהתאם, אחד התרחישים שניתן להעלות על הדעת הינו שטיפול ב"קנון" גורם לירידה מהירה ברמת הביטוי של בקר שלילי זה, הגורמת לייצוב חלבוני ה- NPR1 ובכך תורמת לעלייה בביטוי.PaPR1 עלייה זו מתרחשת למרות שאין עלייה ברמת תעתיק הבקר החיובי. כפי שצוין במבוא ידוע כי הצטברות SA המשחקת תפקיד במנגנון ה"פרימינג", מלווה לעיתים בעלייה בביטוי גני.PALs במקרה שלנו, תוצאות RNA-seq הראו כי בפרט, טיפול הקנון גרר עלייה בביטוי PaPALb אך לא בביטוי,PaPALa שהינו גן שמבוטא בעיקר בשורשים. תוצאות אלו תאמו לתוצאות אנליזות RT-PCR של ניסוי נוב' בהן לא הודגמה עלייה ברמת ביטוי PaPALa לאחר טיפול קנון )ביטוי PaPALb לא נבדק(. התוצאות הללו עשויות לרמוז כי טיפול "קנון" גורם באופן ישיר לעלייה בסינטזת.SA אולם, בכדיי לבדוק אופציה זו יש לבצע אנליזות לכימות רמת,SA באותם דוגמאות עלים ששימשו לאנליזה מולקולרית. לבסוף, יש לציין כי על פי הידע הקיים בספרות, תגובה נוספת המלווה את מנגנון ה"פרימינג" היא פרץ חמצוני המוביל לעלייה ברמת ;(. Conrath et al., 2006Conrath, )2011 ROS בבדיקות ה- ROS שביצענו כאן לא מצאנו השפעה מובהקת של טיפול ה"קנון" על פרמטר זה. לסיכום: מכלול התוצאות שהתקבל על ידינו עד כה מאנליזות RT-PCR מורה כי ככל הנראה באבוקדו טיפול "קנון" משרה מנגנון "פרימינג" הבא לידי ביטוי, בין היתר, בעלייה זמנית בביטוי מספר גנים המקודדים לחלבוני PRs ובירידה ברמת התעתיק של הבקר השלילי של מנגנון ה- SAR,.PaNPR4 כאמור, משך התגובה לטיפול הינו זמני ויתכן שהוא מושפע מגיל השתיל ו/או מתנאים אקלימים חיצוניים. במקביל, תוצאות הטרנסקריפטום, שקיבלנו זה עתה, מורות כי טיפול "קנון" משרה שינוי מהותי ברמת הטרנסקריפטום. במהלך שנת המחקר הבאה בכוונתנו לבדוק באופן מפורט, ע"י מבחני העשרה של,GO RT- את מכלול התוצאות. בכדיי לאמת את התוצאות ולאשש את הממצאים נבצע אנליזות annotation PCR למספר גנים נבחרים במסלולים השונים. באנליזה זו נשווה את דגם ביטויי הגנים בתנאי ביקורת מול טיפול. כמו כן בכוונתנו לבצע ניסויים נוספים בהם טיפולי ה"קנון" ילוו בהדבקת שתילים ב-.Botryosphaeria הצפי הוא כי במקרה זה טיפול ה"קנון" יגרום לעלייה גבוהה אף יותר של גני מערכת ה-.SAR אנו מקווים כי מחקר מעמיק יותר יאפשר לקבל תובנות רחבות יותר באשר לאופן בו "קנון" משרה עמידות בשתילי אבוקדו. תובנות אלו עשויות לא רק לתרום להבנה מעמיקה של הנושא אלא לתרום בגיבוש פרוטוקול יעיל יותר לטיפול "קנון" בשתילי אבוקדו. 6. הבעת תודה ברצוננו להביע תודה לחברת "לוקסמבורג" על הענקת מילגה שאפשרה את העסקת מר אייל חלון בפרויקט זה. 7. רשימת ספרות מצוטטת Backer R, Mahomed W, Reeksting BJ, Engelbrecht J, Ibarra-Laciette E, van den Berg N Phylogenetic and expression analysis of the NPR1-like gene family from Persea americana (Mill.). Frontiers in Plant Science 6, Burra DD, Berkowitz O, Hedley PE, Morris J, Resjoe S, Levander F, Liljeroth E, Andreasson E, Alexandersson E Phosphite-induced changes of the transcriptome and secretome in 32

33 Solanum tuberosum leading to resistance against Phytophthora infestans. Bmc Plant Biology 14, Conrath U Molecular aspects of defence priming. Trends in Plant Science 16, Conrath U, Beckers GJM, Flors V, Garcia-Agustin P, Jakab G, Mauch F, Newman M-A, Pieterse CMJ, Poinssot B, Pozo MJ, Pugin A, Schaffrath U, Ton J, Wendehenne D, Zimmerli L, Mauch-Mani B, Prime APG Priming: Getting ready for battle. Molecular Plant- Microbe Interactions 19, Dempsey DA, Vlot AC, Wildermuth MC, Klessig DF Salicylic Acid Biosynthesis and Metabolism. In: Biologists. ASoP, ed. The Arabidopsis Book. Engelbrecht J, van den Berg N Expression of defence-related genes against Phytophthora cinnamomi in five avocado rootstocks. South African Journal of Science 109. Heath MC Hypersensitive response-related death. Plant Mol Biol , Machinandiarena MF, Lobato MC, Feldman ML, Daleo GR, Andreu AB Potassium phosphite primes defense responses in potato against Phytophthora infestans. Journal of Plant Physiology 169, Mahomed W, Berg N EST sequencing and gene expression profiling of defence-related genes from Persea americana infected with Phytophthora cinnamomi. BMC Plant Biol 11, 167. Pajerowska-Mukhtar KM, Emerine DK, Mukhtar MS Tell me more: roles of NPRs in plant immunity. Trends in Plant Science 18, Perez-Jimenez RM Significant avocado diseases caused by fungi and oomycetes. The European Journal of Plant Science and Biothechnology 2, Qing Fu Z, Dong X Systemic Acquirwed Resistance: Turning Local Infections into Global Defense. Annu. Rev. Plant. Biol. 64, Reeksting BJ, Coetzer N, Mahomed W, Engelbrecht J, van den Berg N De novo sequencing, assembly, and analysis of the root transcriptome of Persea americana (Mill.) in response to Phytophthora cinnamomi and flooding. Plos One 9, e Sels J, Mathys J, De Coninck BMA, Cammue BPA, De Bolle MFC Plant pathogenesisrelated (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry 46, Seyfferth C, Tsuda K Salicylic acid signal transduction: the initiation of biosynthesis, perception and transcriptional reprogramming. Frontiers in Plant Science 5. Torres MA, Jones JD, Dangl JL Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant Physiol 141, Van der Ent S, Van Hulten M, Pozo MJ, Czechowski T, Udvardi MK, Pieterse CMJ, Ton J Priming of plant innate immunity by rhizobacteria and beta-aminobutyric acid: differences and similarities in regulation. New Phytologist 183, Walters DR, Ratsep J, Havis ND Controlling crop diseases using induced resistance: challenges for the future. J Exp Bot 64,

34 8. ניספח א' דגם ביטויים של גנים שונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי לפני ואחרי טיפול ב"קנון" בהתאם לתת- קבוצות )clusters( שהתקבלו. )בסוגרים מצוינים מספר הגנים בעלי דגם ביטוי ספציפי בתוך כלל תת- קבוצה. 34

35 פרק 4. התמודדות עם מחלת הבוטריוספריה בנשירים דו"ח לשנת המחקר השנייה המוגש לוועדת ההיגוי של מיזם חוס"ן בוטריוספריה ע"י דוד עזרא, חופית קול מימון, רן שולחני ודני שטיינברג המחלקה למחלות צמחים וחקר העשבים, מנהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני, בית דגן מעיין גולני חברת לוכסמבורג תעשיות בע"מ, תל-אביב תקציר 1. בשנתיים האחרונות בחנו במסגרת מיזם חוסן בוטריוספריה את מעורבותן של פטריות מקבוצת הבוטריוספריה בהתמוטטות שתילי נשירים צעירים ועצים בוגרים. מצאנו כי חומר הרכב הנמצא בבית המקור המשמש להספקת רכב למשתלות הנשירים נגוע בפטריות כולל כאלה המשתייכות לקבוצת הבוטריוספריה ובייחוד בפטריות Neoscytalidium dimidiatum ו - sp..lasiodiplodia בנוסף נצפו על העצים גופי פרי של פטריות רקב שונות. בשנת המחקר האחרונה, בדקנו את מעורבותן של פטריות הרקב בנוסף למעורבות פטריית ה - Neoschytalidium בתופעה, כמו כן בדקנו שימוש בשני חומרי הדברה במטרה לנקות חומר רכב מגורם המחלה. בחנו גם את נוכחות הפטרייה בחלקים שונים של חומר הרכב הנלקח מעצים במטע )עין לעומת מפרק(. בנוסף, ביצענו ניסויים בהם נבחנה האפשרות כי השקיה או ריסוס של חומר המעורר את מערכות ההגנה של הצמח )חומצה פוספיטית- קנון( ישפיע על התפתות המחלה במטעים. 2. מבוא בשנים האחרונות אנו בוחנים את מעורבותן של פטריות ממשפחת הבוטריוספריה בתופעת התייבשות של שתילים צעירים ועצים מבוגרים ממשפחת הנשירים ובעיקר משמש, נקטרינה, אפרסק ושזיפים. במסגרת זו זיהינו והגדרנו מספר פטריות מדוגמאות עצים חולים בניהן בלטו הפטרייה Neoscytalidium dimidiatum ו -.N במבחני קוך שבוצעו הראינו שהדבקה של עצים צעירים בתנאי מעבדה בפטרייה.Lasiodiplodia sp. dimidiatum גרמו להופעת תסמינים המוכרים מהמטעים אך עם זאת עצים אלה בדרך כלל לא מתו כתוצאה מהדבקות אלה. בתחילת הפרויקט בחנו את עצי המקור לחומר רכב המשמש את המשתלות לייצור שתילים לחקלאים. במטע המקור ראינו כי על העצים ישנן פטריות רקב רבות. במהלך המחקר ובמיוחד בשנה האחרונה זיהינו כי על הרבה מבן העצים במטעים המבוגרים יותר אנו רואים בנוסף להפרשת השרף המזוהה עם התקפת פטריות הבוטריוספריה גם גופי פרי של פטריות רקב. בתחילה העלינו את ההשערה כי פטריות רקב אלה הינן משניות ומופיעות על העצים בגלל חולשתם הנובעת מהמחלה הנגרמת על ידי פטריות בוטריוספריה אך עם הזמן עלתה המחשבה ואתה ההבנה כי יתכן ודווקא מעורבות משותפת של שתי הפטריות )רקב ובוטריוספריה( היא שאחראית על ההידרדרות של העצים והתייבשות הענפים כאשר כל אחת מהפטריות תורמת את חלקה להליך. בשנת המיזם השנייה עמדו לנו מספר מטרות: 1. לבחון ולייצר פרוטוקול ניקוי לחומר רכב )עיניים( על ידי שימוש בחומרי הדברה שנמצאו יעילים כנגד הפטרייה ;.N dimidiatum 2. לבחון את נוכחות הפטרייה 35

36 בחלקים השונים של חומר הרכב ובעיקר באזורים המוגדרים כ"עין" ו"מפרק"; 3. ביצוע מבחני קוך עם פטריית הרקב פלינוס שבודדה מעצים חולים בנפרד ובשילוב עם ;.N dimidiatum 4. לבחון את השפעת מתן "קנון" לעצים מבוגרים על התפתחות המחלה והבראת העצים. 3. תיאור הניסויים שבוצעו בסעיף זה יפורטו בקיצור שיטות העבודה בהם השתמשנו. פרטים אודות הטיפולים בניסויים ודרכי הבדיקה שבצענו יפורטו בהמשך. 3.1 טיפול בחומר רכב כנגד פטריות בוטריוספריה בחינת חומרי הדברה וריכוזים מתאימים לטיפול בחומר הרכב היות וחומר הרכב שהגיע מבית המקור הינו חשוד כמקור אפשרי להפצת המחלה בעצים הצעירים החלטנו כבר בשנה שעברה לבחון דרכים לטיפול בחומר הרכב בעזרת חומרי הדברה לפני הליך ההרכבה. בכדי שצעד כזה יהיה יעיל יש תחילה לקבוע מהם חומרי ההדברה היעילים ביותר כנגד הפטרייה.N dimidiatum ולאחר מכן לבחון מהם משכי הזמן והריכוזים שיהיו יעילים כנגד גורם המחלה אך לא יפגעו בחומר הרכב בצורה שלא תאפשר את גידולו התקין. בשנה שעברה דיווחנו על ניסויים לבחינת יעילות חומרי ההדברה במבחני מעבדה על מצעים מורעלים. השנה בחנו שני חומרים שנמצאו במבחנים המוקדמים כיעילים ביותר: סוויץ ומיראז'. עצים של משמש או קנה 677 שימשו כמקור רכב. העצים הודבקו באופן יזום בתרחיף נבגים של פטריית ה -.N dimidiatum על ידי גידולה על גבי מצע מזון PDA למשך כשבוע שלאחריו כעשרה מ"ל מים סטריליים הוספו לצלחת והתפטיר גורד בעזרת מקל דריגלסקי סטרילי. הנוזל המכיל נבגים וחתיכות תפטיר הועבר דרך שלוש שכבות של גאזה סטרילית וריכוז הנבגים נקבע על ידי ספירתם תחת מיקרוסקופ. העצים הודבקו בריכוז 6 של 10, נבגים לסמ"ק בניסוי אחד. בניסוי אחר העצים הודבקו בתרחיף נבגים בריכוז של 10 4 ו ההדבקה בוצעה על ידי ריסוס עניים בתרחיף או על ידי הנחת 10 מיקרוליטר של תרחיף נבגים על העין עצמה. מספר עצים הושארו ללא הדבקה כביקורת. לאחר כשבועיים מקלות הרכבה הנושאות עניים מודבקות הורדו מהעצים כמקובל, מקלונים אלה הועברו לטיפול בחומרי ההדברה סוויץ בריכוז 0.1% ו מיראז' בריכוז 0.1%. הטיפול עצמו בוצע על ידי טבילת המקלונים בתמיסת חומר ההדברה למשך 20 דקות. במקביל חומר מודבק שלא הועבר טיפול בחומרי הדברה נשמר בכדי לשמש ביקורת להשפעת ההדבקה על העניים. בכדי לוודא שההדבקה על ידי הנבגים הצליחה מספר מקלונים שימשו לבידוד הפטרייה מחומר הרכב. מהמקלונים הורדו עניים מיד לפני הרכבתם על צמחי קנה 677 נקיים. שלוש עצים לכל טיפול כשעל כל עץ הורכבו שלוש עניים מכל טיפול כלומר היו סה"כ 9 חזרות לכל טיפול בכל ניסוי. העניים שהורכבו נעטפו כמקובל בסרט הרכבות והושארו לקליטה למשך כשלושה שבועות. העצים עצמם הוחזקו לאורך כל התקופה בחדר גידול בטמפרטורה של 25 מ"צ. לאחר כחודשיים וכל שבוע לאחר מכן העיניים נבחנו לפריצה )גידול עלים(. הטיפולים שבוצעו היו: הדבקה בריכוז גבוהה ( 6 10 או 10 4 תלוי בניסוי( הדבקה בריכוז נמוך ( 2 10( הדבקה בריכוז נמוך + טיפול בסוויץ הדבקה בריכוז גבוהה + טיפול בסוויץ הדבקה בריכוז נמוך + טיפול במיראז' הדבקה בריכוז גבוהה + טיפול במיראז' ללא הדבקה בנבגים +טיפול בסוויץ ללא הדבקה בנבגים + טיפול במיראז' ללא הדבקה וללא טיפול בחומרי הדברה )ביקורת( 36

37 3.1.2 בחינת נוכחות הפטריה בחלקים השונים של חומר הרכב ובעיקר באזורים המוגדרים כ"עין" ו"מפרק" בשבעה מקרים שונים במהלך שנתיים )ינואר 14, אוקטובר 14, נובמבר 14, ינואר 15, מרץ 15, נובמבר 15 וינואר ) 16 מקלונים שהובאו למעבדה ממטעי נקטרינה, שימשו לבחינת האפשרות שהפטרייה נמצאת בעניים אך לא במפרקי הענפונים. הבידודים בוצעו על ידי ביצוע סטריליזציה חיצונית של המקלונים על ידי טבילתם למשך דקה בתמיסת כלור 3% ולאחר מכן שטיפה פעמיים במים מזוקקים סטריליים. המקלונים נחתכו בעזרת מזמרה שחוטאה כך שהתקבלו המפרקים )חלקים שבן העניים( והעניים. חלקים אלה נחתכו והונחו על צלחות מצע מזון סינטטי המעודד גדילת פטריות מהחומר הצמחי אל המצע ( 0.25%.)PDA הצלחות נבחנו לגדילת פטריות שהוגדרו כבוטריוספריה באופן ויזואלי בלבד לאחר כחמישה ימים וכל יום לאחר מכן ועד להתמלאות הצלחת בתפטיר פטריות. מספר הפטריות שזוהה כבוטריוספריה נספר בכל הניסויים וממוצע חושב לשני החלקים הנבדקים ביצוע מבחני קוך עם פטריית הרקב פלינוס שבודדה מעצים חולים בניפרד ובשילוב עם.N dimidiatum 19 צמחי משמש ו 19 צמחי נקטרינה שימשו לביצוע מבחני קוך עם פטריות הרקב sp.. Phellinus פטריה זו בודדה במרבית המקרים בהם בוצעו בידודים מחומר צמחי שהובא למעבדה ממטעים נגועים בבוטריוספריה. הפטרייה זוהתה על בסיס מולקולרי תוך שימוש בטכנולוגית ה PCR והתחלים ייחודים לאזור השמור ב DNA הריבוזומלי והשוואת הרצף שהתקבל למאגרי הגנים שב.NCBI הדבקות העצים בוצעו על ידי חיתוך השיפה עד לעצה, הנחת פיסת מצע אגר המכיל תפטיר חיי של הפטרייה עטיפה בצמר גפן רטוב ובפרפילם למניעת התייבשות. ההדבקה בוצעה באופן זהה גם לפטריית הפלינוס וגם לפטריית ה - dimidiatum.n בהדבקה המשולבת פטריית הפלינוס הודבקה בחלקו התחתון של הגזע בעוד פטריית הבוטריוספריה בחלק העליון. הדבקות קוך בוצעו באופן הבא: 4 צמחי ביקורת לא מודבקים )בוצע חיתוך ועטיפת החתך בלבד( 5 צמחים שהודבקו בבוטריוספריה בלבד 5 צמחים שהודבקו בפלינוס בלבד 5 צמחים שהודבקו בבוטירוספריה ופלינוס יחדיו ההדבקה בוצעה ב והצמחים הוחזקו בבית זכוכית תוך השקיה יומית של 30 דקות לכל צמח. לאחר חודש ובכל שבוע הצמחים נבחנו לתסמיני מחלה ריסוס עצים צעירים ובוגרים בקנון למניעת הדבקה והתפתחות המחלה שש תצפיות )ריסוס שורות שלמות והשארת שורות ביקורת לא מרוססות בן כל שתי שורות( וניסוי אחד )בלוקים באקראי( בוצעו מתחילת הפרויקט ועד לשנה זו. כל הניסויים והתצפיות רוססו )ריסוס רובים( והוגמעו כל חודשיים, ריסוס בריכוז של 0.3% והגמעה בכמות של 1.5 ליטר לדונם. כל התצפיות והניסויים בוצעו במטעי נקטרינה או אפרסק. בשנת 2012 בוצע ניסוי במושב ביצרון בשתילה צעירה בו נתנו טיפולי ריסוס והגמעה. ב בוצעה ניסוי ותצפית בעצים מבוגרים בכפר אחים בהם ניתנו ריסוס והגמעה. בשנת 2014 בוצעו תצפיות בעצים בוגרים במשגב דוב )ריסוס בלבד(, ערוגות )ריסוס בלבד( עצים צעירים ובעצים מבוגרים )ריסוס בלבד(, יינון )רק ריסוס( ובמושבי הנגב בעצים מבוגרים ובעצים צעירים )ריסוס והגמעה(. כל שלושה חודשים בוצעה הערכה של הנגיעות על ידי תסמינים במטעים. הערכה בוצעה על ידי מעבר בשורות והערכת כל עץ על פי סולם בן 5 דרגות, כלהלן: = 0 עץ ללא תסמינים כלל; = 1 עץ עם תסמינים קלים; = 2 עץ עם תסמינים בינוניים; = 3 עץ עם תסמינים חזקים; = 4 עץ מת מהתייבשות. 37

38 4. תוצאות 4.1 טיפול בחומר רכב כנגד פטריות בוטריוספריה בחינת חומרי הדברה וריכוזים מתאימים לטיפול בחומר הרכב בניסוים ראשונים שבוצעו תוך שימוש בריכוז נבגים גבוה לא נצפתה התאוששות של העניים לאחר ההרכבה באף אחד מהטיפולים, לא בעניים המודבקות שלא טופלו בחומרי ההדברה )טיפול 1 ו- 2 ( ולא בטיפולים שעברו טיפולי חומרים )טיפולים 3-7(. הסקנו מכך שריכוז הנבגים היה כנראה גבוהה מידי והרג את העניים. ולכן בניסוים הבאים השתמשנו בריכוז נבגים נמוך יותר של 10 4 ו בלבד. יש לזכור כי באופן טבעי לא סביר שעין אחת תודבק ביותר ממספר בודד של נבגים ולכן הדבקה במספר מאות ( 2 10( הינו ריכוז גבוהה מספיק באופן עקרוני. באחד הניסויים נצפתה על העניים המורכבות כחודש לאחר ההרכבה פטריית עובש וגם לאחר הורדת סרט ההרכבה הפטרייה לא נעלמה בנוסף, העניים התייבשו ולא פרצו. הניסוי האחרון הועמד ב באותה מתכונת. נכון ליום כתיבת דוח זה בביקורת ללא הדבקה מתוך שלוש עצים )תשע חזרות( רק שתי עניים פרצו )איור 1(. בשאר העצים ניתן לראות שהעניים ירוקות וחיות אך עדיין לא נצפתה פריצה של עלים. אנו ממתינים לפריצת העלים בכדי לקבוע איזה מהטיפולים עדיף איור מספר 1. דוגמאות לעניים לאחר טיפול והרכבה. א. ביקורת ללא הרכבה וללא טיפול; ב. הדבקה ב 10 4 נבגים למ"ל וטיפול בסוויץ; ג. הדבקה ב 10 4 נבגים למ"ל וטיפול במיראז' בחינת נוכחות הפטרייה בחלקים השונים של חומר הרכב ובעיקר באזורים המוגדרים כ"עין" ו"מפרק" כאמור הניסוי בוצע 7 פעמים כאשר בסה"כ היו 110 צלחות לבידוד מהעיניים ו 109 צלחות לבידוד מהמפרקים. בכל צלחת הונחו חמש דוגמאות כלומר סה"כ נבחנו 550 עיניים ו- 545 מפרקים. ב 6.14±2.6% מהעיניים בודדו פטריות שזוהו כמשתייכות לקבוצת הבוטריוספריה בעוד בחלקים שבין הפקעים )מפרקים( לא בודדו פטריות מקבוצה זו אפילו פעם אחת. 38

39 4.1.3 ביצוע מבחני קוך עם פטריית הרקב פלינוס שבודדה מעצים חולים בנפרד ובשילוב עם.N dimidiatum הדבקות מבחן קוך נבדקו בפעם הראשונה כחודש לאחר ההדבקה ונמצא כי בכל אתרי ההדבקה בפטרייה.N dimidiatum נמצאה הפרשת שרף )איור 2 א( וכחודשיים וחצי לאחר ההדבקה ניתן היה להבחין בבירור בנמק )איור 2 ב ו - ג (. לעומת זאת בהדבקה בפטריית הפלינוס לא נראים תסמינים חיצוניים ( איור 3 א(, בדומה לביקורת )איור 3 ב(. N. dimidiatum -הפרשת שרף נצפתה באתרי ההדבקה בפטרייה.N איור מספר 2. תסמיני הדבקת העצים ב dimidiatum כבר לאחר חודש מההדבקה )א(. נמק )נקרוזה( נצפתה כחודשיים וחצי לאחר ההדבקה )ב ו ג( איור מספר 3. הדבקה בפלינוס. בהדבקה בפלינוס גם לאחר חודשיים וחצי לא נצפו תסמינים חיצוניים )א( בדומה לביקורת הלא מודבקת )ב(. החצים מסמנים את נקודת ההדבקה 39

40 בחיתוך אזורי ההדבקה מתגלה תמונה שונה לחלוטין. גם בהדבקה ב - dimidiatum.n וגם בפלינוס נראו החמות הנמתחות בעיצה. )איור 4 ב ו ג בהתאמה( החמות אלה לא נצפו בחיתוך האזור המקביל בביקורת )איור 4 א(. בחיתוך אזורי ההדבקה בהדבקה המשולבת נראות ההחמות בדומה להדבקות הבודדות )איור 4 ד- ו(. איור מספר 4: תסמינים מהדבקת העצים בשתי הפטריות בחיתוך השיפה. א. ביקורת לא מודבקת, ב. הדבקה בפלינוס בלבד, ג. הדבקה ב - dimidiatum.n בלבד, ד. הדבקה משולבת, ה. ההדבקה ב - dimidiatum.n בהדבקה המשולבת, ו. ההדבקה בפלינוס בהדבקה המשולבת. החצים מורים על אזורי ההדבקה ריסוס עצים צעירים ובוגרים בקנון )חומצה זרחיתית( למניעת הדבקה והתפתחות המחלה מלבד ניסויי הריסוס על עצים צעירים בהם נראתה השפעה חיובית ב על התמוטטות עצים במטע הצעיר )דווח בדוח סיכום שנה א' - עמוד 24-25(, בשאר התצפיות שבוצעו בעצים בוגרים הן בהגמעה והן בריסוס לא ראינו הבדלים מהותיים בין עצי הביקורת לעצי הטיפולים. 40

41 5. דיון כדי לפתח פרוטוקול לייצור חומר רכב בריא, ובעיקר בפקעים )עיניים(, ביצענו במהלך השנתיים האחרונות חמישה ניסויים. בשני ניסויים שבצענו בשנת המיזם הראשונה התמקדנו בחומר ששימש להרכבת ראש ובשלושת הניסויים שבצענו בשנה זו התמקדנו בטיפול בעיניים. נכון לרגע כתיבת דו"ח לא ניתן להגדיר באם הטיפולים שהיו בתנאי מעבדה יעילים אכן פעלו גם בחומר הצמחי מאחר ואנו ממתינים לפריצת העלים בניסוי האחרון. בנוסף יש לבסס את הפרוטוקול על פי ממצאים אלה שיתקבלו בעוד כחודש להערכתנו על ידי חזרות נוספות באותם התנאים ועל פי התוצאות. תוצאות בחינת המצאות הפטרייה.N dimidiatum בחלקים המהווים חומר רכב )מפרק ופקע( מראים שהפטרייה שוכנת באופן בלעדי בפקעים ולא במפרקים. לכן יש לשים דגש על טיפול בפקעים בכדי להימנע מהעברתה לשתילים חדשים צעירים בדרך זו. הממצא גם תומך בתצפיות בהן נמצא שהפרשת שרף נמצאה לרוב בפקעים של הענפונים הצעירים במטעים הנגועים ובנוסף יכול להסביר את המעבר בחומר הרכב. מממצאי המחקר שבצענו השנה התבררה המעורבות והחשיבות של פטריות רקב בהתמוטטות העצים כבר בשלבים הראשונים ויתכן אף במעבר עם חומר הרכב. נראה שפטריות הרקב פועלות במשותף ובמקביל לפטריות הבוטריוספריה וגורמות להחלשת העצים. יתכן כי השיתוף בין הפטריות הוא המשמעותי ביותר מבחינת התפתחות המחלה לאורך זמן. יותר מכך, ממצא זה מסביר את התמוטטות העצים הבוגרים בשלב מאוחר יותר. אם הבנו בשנה הראשונה שעצים השורדים את נוכחות הבוטריוספריה בשתילים לאורך השנה הראשונה ימשיכו לחיות אבל יהיו מעוכבים ולאחר מספר שנים ימותו מהמחלה, הרי שהיום אנחנו יכולים לשער שהניוון הנמשך נובע כנראה מהתפתחות שתי הפטריות בעצים במקביל. בשלב מאוחר יותר פטריות הרקב גורמות נזק לעצה בעוד הבוטריוספריה כנראה אחראית לנזק היותר משמעותי בשיפה. בהדבקות שביצענו עם שתי הפטריות ניאוסכיטרלידיום )בוטריוספריה( ופלינוס )רקב( אפשר לראות שהניאוסכיטאלידיום גורמת לזיבת שרף והתמוטטות של השיפה באזור ההדבקה אך גם לסימני החמה בעצה בעוד הפלינוס לא גורמת לתסמינים בשיפה אבל גורמת להחמות בעצה. אפשר לשער כי בשלב מסוים שתי הפטריות מכריעות את העצים על ידי גרימת עקה שבה הניאוסכיטאלידיום גורמת לחיגור של השיפה והתייבשות של הענף שנמצא מעל. אפשר לראות את הנזק הנגרם לשיפה כבר בהדבקות בתמונה 2. בשנה הראשונה של המיזם בוצע ניסיון להשתמש בקנון כמעורר מערכת ההגנה בעצים צעירם. בניסוי שבצענו אז התקבלה תגובה חיובית לריסוס החומר על העצים. בתצפיות שבצענו בשנה השנייה של המיזם התמקדנו בעצים מבוגרים. ניסינו לבחון באם ריסוס העצים או הגמעה שלהם בקנון ישפיע על התפתחות המחלה ועל הופעת התסמינים. באף לא אחד מהניסויים ו/או התצפיות נראו הבדלים בין הביקורת הלא מטופלת לחלקות המטופלות. מכך אנו מסיקים כי אין לקנון השפעה על הופעת התסמינים בעצים המבוגרים. 6. הבעת תודה אנו מודים לחקלאים שאפשרו לנו לבצע את ניסויי הריסוס קנון בחלקות שלהם. 41

42 פרק 5. פיתוח כלים לאפיון מעבר אוכלוסיות הפטריות מקבוצת הבוטריוספריה בין מאכסנים שונים דו"ח לשנת המחקר השנייה המוגש לוועדת ההיגוי של מיזם חוס"ן בוטריוספריה ע"י עומר פרנקל, חופית קול מימון; דוד עזרא, דני שטיינברג, סטנלי פרימן, אורנה ליארזי, רן שולחני, מיכל שרון ומיכל הרשקוביץ המחלקה לפתולוגיה של צמחים וחקר העשבים, מינהל המחקר החקלאי, בית דגן 1. תקציר בשנים האחרונות עולה החשיבות של מחלות אותן גורמות פטריות מקבוצת הבוטריוספריה ברחבי העולם וכך גם כמות הידע המפורסם. עם זאת רוב הידע הגנטי מתמקד בהרכב מיני הפתוגנים המצוי על המאכסנים השונים וקיים ידע מועט מאד על הבדלים בתוך אוכלוסיות הפתוגנים. צבירת ידע זה משמעותית ביותר כדי להבין האם מיני פתוגנים מרכזיים בתנאי הארץ )כלומר LT, LPT ו-.N )dimidiatum יכולים לעבור בין מאכסנים שונים וכדי ללמוד ולהבין מהם מקורות המדבק הראשוניים והשניוניים. מטרות המחקר הינן: 1( פיתוח כלים מולקולרים ופילוגנטים לזיהוי קבוצות גנטיות שונות ברמות המינים ואוכלוסיות בתוך מיני הפתוגנים: (LT).N dimdiatum;.l theobromae ו - (LPT) 2(.L pseudotheobromae שימוש ראשוני בסמנים הנ"ל לזיהוי מבנה האוכלוסיות הפתוגן בדגש על הבדלים במבנה אוכלוסיות הפתוגנים על גבי מאכסנים שונים. במסגרת המחקר פותחו סמנים שונים, החל מריצוף גנים אינפורמטיבים עבור לימוד אוכלוסיות ה.N, dimidiatum נסרקו סט של סמני SSRs ופותחו סמני SCAR עבור הפתוגנים.L theobromae ו -.L.pseudotheobromae. מבדיקה ראשונית בלבד של הסמנים על אוכלוסיות הפתוגנים, נראה כי קיימים מספר האפלוטיפים גנטיים על מאכסנים שונים וכי ההתאמה למאכסן איננה הגורם היחיד המכתיב את מבנה האוכלוסיות. נושא זה ייבדק לעומק בהמשך השנה. 2. מבוא בשנים האחרונות מתגברים הדיווחים על נזקי מחלות בהם מעורבות פטריות מקבוצת הבוטריוספריה. במהלך השנה הקודמת דווח כי הפתוגנים המרכזיים שבודדו בעצי פרי בישראל שייכים לשני קבוצות שונות. פטריית ה Neoschytalidium dimidiatum נצפתה בייחוד בנשירים ופטריות ה - spp. Lasiodiplodia נצפו במגוון רחב יותר של מינים כולל אבוקדו, נשירים, גפנים, מנגו ועוד מינים רבים. למרות שפטריות אלו נצפו במקומות רבים בעולם, המידע הגנטי על האוכלוסיות הללו מצומצם ביותר. מידע זה חשוב בהרבה מעבר לרמה התאורטית ודרוש כדי להבין האם קיים מעבר אוכלוסיות חופשי בין מיני המאכסנים השונים ואם אכן 42

43 קיימים הבדלים גנטיים, אזי כיצד הם מתבטאים מבחינה אקולוגית ואפידמיולוגית במאכסנים השונים. כיום, ברובם המכריע של העבודות המידע מבלבל וסותר, כך למשל למעט עבודה אחת לא נבחנו כלל ההבדלים בתוך קבוצת ה lasiodiplodia בין שני המינים הקריפטים LT ו - LPT.)Boyogueno et al., (2012 מינים אלו הוגדרו על ידי al., )2010( Alves et ומחייבים התייחסות מחודשת וזהירה לכל ההבדלים הגנטיים שנמצאו בתוך האוכלוסיות של spp. Lasiodiplodia עד פרסום זה. היפותזת העבודה הראשית היא כי קיימות מספר אוכלוסיות נפרדות גם בתוך כל אחד משלושת מיני הפתוגנים אשר ניתנים לזיהוי בעזרת כלים מולקולריים. האוכלוסיות יכולות לעבור בין מאכסנים שונים אך קיימים ביניהם הבדלים במידת הכשירות )fitness( למאכסנים אלו ולתנאים סביבתיים ואקולוגים המועדפים על ידי האוכלוסיות השונות. מטרות המחקר הספיציפים הינן: 1. פיתוח כלים מולקולרים ופילוגנטים לזיהוי קבוצות גנטיות שונות ברמות המינים ואוכלוסיות בתוך מיני הפתוגנים: (LT) N. dimdiatum ; L. theobromae ו - (LPT). L. pseudotheobroma 2. שימוש ראשוני בסמנים הנ"ל לזיהוי מבנה האוכלוסיות הפתוגן בדגש על הבדלים במבנה אוכלוסיות הפתוגנים על גבי מאכסנים שונים. 3. תיאור הניסויים שבוצעו 3.1 פיתוח כלים מולקולרי עבור לזיהוי הקבוצות הגנטיות שימוש בריצוף קבוצות גנים אינפורמטיביים לזיהוי פולימורפיזם בתוך האוכלוסייה פרימרים עבור אנליזת ה typing) MLST (Multilocus sequencing בוצעה עבור כל אחד ממיני הפטריות בעזרת פרימרים שסונתזו לאזורים השמורים של הגנים הבאים beta-tubulin, Chitin synthase, calmadulin, EF-1α Internal transcribe spacer (ITS), Actin על פי (1999) Kohn,.Carbon & רצפי הפרימרים מופיעים כחלק מטבלה 1 בפרק התוצאות. רצפי הגנים נשלחו לריצוף בחברת,Macrogen הרצפים עובדו בעזרת תוכנת.Bioedit שימוש בסמני SSRs לזיהוי קבוצות גנטיות תוך מיניות ב - theobromae.l ו-.L pseudotheobromae בוצעה סקירת ספרות עבור כל הסמנים הקיימים בתוך קבוצת ה -,Lasiodiplodia שמונת הסמנים הנבחרים סומנו פלאורוסנטית ברצף ה Forward primer ובוצעה ראקציית PCR בתנאים המפורטים על ידי Burgess PCR תוצרי ה.55ºC של annealing עם טמפרטורת Cordoso & Wilkinson (2008) - ו et al., (2003) נשלחו לאנליזת גודל analysis) (fragment במרכז לטכנולוגיות גנומיות באוניברסיטה העברית בירושלים ונותחו בעזרת תוכנת.Peak Scanner פיתוח סמני Region) SCAR (Sequence Characterized Amplified כדי להגדיל את מספר הסמנים הפולימורפים התוך מיניים בוצע חיתוך מג'ל של תוצרים פולימורפים שהוגברו בעזרת (el-morsi et al., (2012 arbitrary primer OPA7 תוצרים אלו הופקו מהגל ושובטו לתוך פלסמיד בעזרת קיט (Geneall).Clone-jet עבור כל תוצר פולימורפי בוצעו עשרה ריצופים לכיסוי טוב של הרצף. התוצרים הושוו בעזרת תוכנת Clustal W לזיהוי אזורים חופפים ושימשו ופיתוח פרימרים ספציפיים. 3.2 שימוש ראשוני בסמנים לזיהוי מבנה אוכלוסיות הפתוגן והבדלים במבנה האוכלוסיות על מאכסנים שונים עבור רצפי ה MLST באוכלוסיות ה.N dimidiatum )ארבעת הגנים בהם נמצאה שונות גנטית אינפורמטיבית( נבנו עצים פילוגנטיים באמצעות תוכנת.MEGA 6 העץ הפילוגנטי נבנה בעזרת שיטת Maximum likelihood method ו 100 הרצות Bootstraps לחישוב אורכי הענפים. 43

44 סמני ה - SSRs וה SCAR האינפורמטיביים נותחו בעזרת תוכנת Genalex6.3 כ, אוכלוסיות הוגדרו תבדידים שמקורם במאכסנים הבאים: 1( אבוקדו, 2( מנגו, 3( גפן, 4( נשירים )אפרסק נקטרינה ותפוח( ו - 5( מיני בר ונוי שונים. חושבו שכיחות האללים, המגוון הגנטי בתוך כל קבוצה ומטריצת המרחק הגנטית. הבדלים בין הקבוצות נבחנו במבחן variances).amova (analysis of molecular 4. תוצאות 4.1 שימוש בריצוף קבוצות גנים אינפורמטיביים לזיהוי פולימורפיזם בתוך האוכלוסייה ריצוף ששת הגנים של 11 תבדידי.N dimidiatum גילה אתרים פולימורפים גם בתוך המין )טבלה 1(. הגן הפולימורפי ביותר היה ITS עם 11 אתרי.SNPs שלושת הגנים Calmadulin Actin ו - CHS היו בעלי אתרים פולימורפים שחילקו את האוכלוסייה לקבוצות שונות זו מזו ומחלוקת ה.ITS לעומת זאת גן beta tubulin וה - EF-1α היו בעייתיים לריצוף ובעלי פולימורפיות נמוכה מאד בהתאמה והוצאו מתוך האנליזות העתידיות. רצפי ארבעת הגנים האינפורמטיביים שימשו לאנליזות של מטרה 2. טבלה מספר 1: טבלה המסכמת את ההבדלים הגנטיים בין 11 רצפי תבדידי ה.N. dimidiatum ארבעת הגנים המודגשים שימשו לבנית עץ פילוגנטי. * גן מספר האפלוטיפים )קבוצות גנטיות( % הומולוגיה בין תבדידים מספר אתרים פולימורפים (SNPs) גודל הפרגמנט המרוצף )bp( ITS CHS ACT CAL Bt EF Y * ITS--internal transcribe spacers; bt1- Beta tubulin; ACT-Actin; CAL-Calmadulin; CHS-Chitin synthase; EF1-Elongation factor 1α. שימוש באותם ששת הגנים עבור 8 תבדידי הפתוגנים.L theobromae ו - pseudotheobromae.l, הראה הבדלים ברורים בין תבדידים משני מיני הפתוגנים הקריפטים )בין 2 ל.(SNPs 10 עם זאת לא נמצאו כלל הבדלים בין תבדידים מאותו מין. בעקבות תוצאות אלו לא בוצע יותר שימוש ב MLST עבור הפטריות הנ"ל והמאמץ עבר לניתוח סמני microsatellite ו -.SCAR שימוש בסמני SSRs לזיהוי קבוצות גנטיות תוך מיניות ב - theobromae.l ו.L pseudotheobromae שמונה סמני SSRs נבדקו כל אחד על עשרה תבדידים של LT ו,LPT הנתונים מוצגים בטבלה 2. ככלל השונות הגנטית הייתה נמוכה מאד, מתוך 8 סמנים רק חמישה סמנים הבדילו בין אוכלוסיות LT ו - LPT ומתוכם רק שלושת הסמנים LAS3, LAS21 ו LAS27 היו פולימורפים בתוך אוכלוסיית הLT, דבר המאפשר לימוד מבנה אוכלוסיות תוך מיני. בסריקה הראשונית לא נמצאה שונות גנטית בתוך תבדידי ה.LPT 44

45 טבלה מספר 2: סריקת שמונת סמני ה SSRs עבור אוכלוסיות LT ו.LPT סמנים המודגשים בשחור הראו שונות בין מינית ושונות תוך מינית עבור תבדידי ה.LT מספר אללים LPT מספר אללים LT שונות תוך מינית שונות בין מינית תוצר LT שם ורצף הפרימר LAS3 F:GACTCATTCACGGTCTCATGG R: GTGGAGCGGAACTGTCTGCT LAS13 F:GAGTTGTTAGTGCGGGCGCC R:GCAGCCCCACAATTCACCAG LAS15 F:GCCAGATCCGTGCCCACTG R:CATGCAGAGGTCGCAAAGTG LAS21 F:GGAAGATGATGGGATGGTTGC R:GTACAAGAACGAACTCCGGGT LAS25 F:GTATTGCAAGGTGAGCAAGAG R:GTAGATGGCGTGTATCATCCT LAS27 F:CGAACAGGGTTTCGTGACGT R:CTCATATCTCGCCGGTTGCC LAS35 F:GGCATCACAACGACCAACCC R:GCGAGAGTCGCAAGTACAGC BLAS F:GTAGATGTGGTCGCGGAGTT R:TCCCCCATGTATACCAGGTC תוצר LPT Y Y Y Y 3 1 N N N N 0 0 Y Y N N 1 1 Y Y Y Y 2 1 Y Y Y N 1 1 Y Y Y Y 2 1 N Y Y N 1 0 Y Y Y N פיתוח סמני (Sequence Characterized Amplified Region) SCAR שימוש ברצף החוזרני OPA7 חשף מספר נרחב של בנדים בעלי פוטנציאל לשמש כסמנים פולימורפים )איור מספר 1(. 24 בנדים שונים נוקו מהג'ל, רוצפו ותוכנן עבור כל אחד מהם זוג פרימרים אשר נבדק על לפחות עשרה תבדידים מכל מין פתוגן. הרוב המוחלט של תוצרים אלו כלל כמצופה אזורים חוזרניים רבים וטרנספוזומים או שלא נצפו הבדלים בגודל התוצר בתוך כל מין פתוגן )טבלה 3(. מתוך 24 התוצרים שנוקו מהג'ל ורוצפו הצלחנו לייצר סמן אחד אמין בעל אופי קו-דומיננטי ופולימורפי גם עבור אוכלוסיות ה LT )שני אללים בגודל 450 ו בסיסים( וגם עבור אוכלוסיות הLPT )ארבעה אללים גודל , 0, ו 700(. 45

46 איור מספר 1: תוצרי AP-PCR עם הפרימר OPA7 עבור תבדידי LT ו -.LPT התוצרים בגדלים שונים מסומנים בעיגולים בצבעים הבאים, כחול= 450 בסיסים, ירוק= 500 בסיסים, אדום= 450 בסיסים וצהוב = 350 בסיסים. התוצרים נחתכו ושמשו לייצור סמני.SCAR טבלה מספר 3: רשימת 24 סמני ה SCAR אשר פותחו על סמך ריצוף תוצרי ה arbitrary primer החוזרני OPA-7 שנחתכו מהגל. אופי תוצרים מונומורפי )תוצר אחיד ללא שונות(, רב אללי )סמן דומיננטי לא אמין( ואי הופעת תוצר נפסלו לשימוש. סמן 9A2 המודגש, נמצא אמין ושימש לאנליזות בפרק הבא מקטע מרוצף F primer B primer התאמה כסמן אופי תוצר 1A1 AGTTCTCGATGGGTTGGTGT TGCTTCGCGTAGTTGATTGG X monomorphic 1A1-2 GCTGTCGACGATTAGCAGAC ACCTTGACCTCACATCTGCA X monomorphic 1A2 GGGAGGATGTTCAGGCGATA GCTTTTCCCGTCAGTTCTCG X no bands 1A2-2 GGGAGGATGTTCAGGCGATA GCTTTTCCCGTCAGTTCTCG X no bands 2A1 TATTGAAGTGAAGGGCCCGT CGATTTTCCATGGCAGCTGA X monomorphic 2A1-2 TCGTAGTTGGAAGAAGCGGT GGAAGATGGGTTCGCGTAGA X no bands 2A2 TTATACCGACCCTTCCCAGC CGATTTTCCATGGCAGCTGA X monomorphic 2A2-2 GGAAGATGGGTTCGCGTAGA TATTGAAGTGAAGGGCCCGT X monomorphic 3A1 TAGCAGACTTCAAAAGCGCG CGATCGCAAATTCGCCTGAT X monomorphic 4A1 CGACTTTTTCGGAGACTTGC CGATTCTCGCTAGCTGTTCC X monomorphic 6A1 AAGCTGAGTCTGGTGCTTCT CTGATGCGCCAAAGTTCTCA X multiple bands 6A1-2 AGGTATGTAGGCGGTGCTAC GAGGCGGATAAAGTTGCAGG X no bands 6A2 AGGTATGTAGGCGGTGCTAC GAGGCGGATAAAGTTGCAGG X multiple bands 46

47 7A1 CACTTCTGCCATTCGTGGAG CGACTCTGCTCTGGTTGGT X monomorphic 7A2 CCTTTACACCAAGCAGCGTT AGACTTGCCTGACACGGTAT X monomorphic 8A1 GGGAACATGACGTAGCACAA CTCTTGCGCCGATTCACTTT X monomorphic 8A1-2 GGGAACATGACGTAGCACAA CTCTTGCGCCGATTCACTTT X no bands 8A2 GCAGCTGTTGTGGGAGAAAA AACATCGATTTCCAGGCAGC X monomorphic 8A2-2 ACACCTCATCAGAACCGTGT GTGAACAGACAGGAGCGAAC X monomorphic 9A1 CGATCTTGAGTTCCGCATCG ACCTCCGACTATCACGATCG X monomorphic 9A1-2 TCGTAGTTGGAAGAAGCGGT GGAAGATGGGTTCGCGTAGA X no bands 9A2 AGAATGGCGATACACTGCTG AGATTCTGGACCGCTGAGTT V co- dominant 5 allels 9A2-2 GGCTGCCGGTTTGATGAATA CAGCAGTGTATCGCCATTCT X monomorphic 10A1 AAGCTGAGTCTGGTGCTTCT TGCGGGCAGAGAATGTTTTC X multiple bands 4.2 שימוש ראשוני בסמנים לזיהוי הבדלים במבנה אוכלוסיות הפתוגנים על גבי מאכסנים שונים הבהרה: חלק זה של הדו"ח הנוכחי מדגים את היכולת לשמש בסמנים הגנטיים שפותחו לזיהוי הבדלים גנטיים בתוך קבוצות הפתוגנים. עם זאת יש להבהיר כי הנתונים המנותחים הינם חלקים ביותר והאנליזה על החלק הארי של התבדידים הנוספים בשלבי ביצוע ותפורסם בדו"ח המסכם של השנה השלישית של המיזם שימוש בMLST לזיהוי מבנה אוכלוסיות ה.N dimidiatum ממאכסנים שונים אחד עשר תבדידי.N dimidiatum שימשו ליצירת עץ פילוגנטי על סמך ארבעת הגנים האינפורמטיבים,CHS ACT,CAL ו -.ITS גם במספר נמוך של תבדידים נראה כי קיימים מספר קבוצות (clades) השונות גנטית זו מזו )איור מספר 2(. הקבוצה המרכזית (1 (clade כולל תבדידים מאפרסק, נקטרינה ודובדבן. הקבוצה השנייה (2 (clade כוללת תבדידים ממשמש ואפרסק; קבוצות 3 כוללת תבדיד בודד מפיטאיה וקבוצה 4 תבדידים ממשמש ושזיף. בשלב זה לא נראה כי קיימת קורלציה בין המאכסן לקבוצות הגנטיות שימוש בסמני SSRs לזיהוי קבוצות גנטיות תוך מיניות ב - theobromae.l ו-.L pseudotheobromae תוצאות ניתוח של כ 120 תבדידי LT ו - LTP עבור סמן 9A2 מופיעות באיור 3. באוכלוסיות ה LP היה ערךh למגוון הגנטי וכלל שלושה אללים, אלל 0, אלל 450 ואלל 600 ששכיחותו הייתה הגבוהה ביותר ונעה בכל המאכסנים בין 50 ל 80% מהדגימות )איור מספר 3 א(. כדי לזהות הבדלים בשכיחות האללים בין המאכסנים השונים בוצע מבחן AMOVA על שכיחות האללים בכל מאכסן )אבוקדו, נשירים, מנגו, גפן ומיני בר(. ערכי ה - Fst היו נמוכים ולא מובהקים 0.399=P כלומר לא נמצאו הבדלים בשכיחות האללים בין המאכסנים השונים. מבחן ראשוני בוצע על נתונים חלקיים של שלושת סמני ה- SSRs )טבלה מספר 4( מנתונים אלו נראה כי סמנים LAS21 ו - LAS27 קיימים עדויות ראשוניות להבדלים בהרכב האוכלוסיות על מאכסנים שונים. נתונים מלאים יינתנו בדוח הבא. אוכלוסיות ה LPT היו בעלי שונות גנטית נמוכה מאד בכל סמני הSSRs. עם זאת סמן 9A2 היה בעל מגוון גנטי גבוה 0.516=h וכלל 4 אללים , 0, ו- 700 )איור 3 ב(. רוב תבדידי LPT בודדו מאבוקדו לכן אין בשלב זה של המחקר משמעות למבחן AMOVA להשוואת שכיחות האללים על גבי המאכסנים השונים. 47

48 טבלה מספר 4: ערכי PhiPT להבדלים בין אוכלוסיות עבור כל אחד מארבעת הסמנים וממוצע הכללי של כל הסמנים.(Tot) ערכים המסומנים בכוכבית מציינים הבדלים מובהקים לפי מבחן (0.05=P). AMOVA OPA9A 3LAS 21LAS LAS27 Tot סמן * * * ערכי PhiPT Probability P. איור מספר 2: עץ פילוגנטי עבור תבדידי..N dimidiatumn תבדידים בצבעים שונים שייכים לענף שונה של העץ הפילוגנטי. 48

49 איור מספר 3. שכיחות האללים של סמן ה - SCAR. OPA9A א. שכיחות האללים מוצגת עבור.L theobromae באוכלוסיות שנדגמו מאבוקדו, נשירים, גפן, מנגו ועשבוניים. ב. שכיחות האללים עבור תבדידי.L pseuotheobromae שנדגמו מאבוקדו, גפן ועשבוניים. 49

50 5. דיון בשנים האחרונות החשיבות של מחלות מקבוצת הבוטריוספריה ברחבי העולם עולה וכך גם כמות הידע המפורסם. אם זאת רוב הידע הגנטי מתמקד בהרכב מיני הפתוגנים המצוי על המאכסנים השונים וקיים ידע מועט מאד על הבדלים בתוך אוכלוסיות הפתוגנים. צבירת ידע זה משמעותית ביותר כדי להבין האם מיני פתוגנים מרכזיים בתנאי הארץ כלומר LT, LPT ו - dimidiatum.n יכולים לעבור בין מאכסנים שונים, וכדי ללמוד מהם מקורות המדבק הראשוניים והשניוניים. למרבה הצער רוב הידע הקיים בעולם על הרכב אוכלוסיות ה - spp. Lasiodiplodia הצטבר לפני ששני המינים המרכזיים LT ו - LPT הופרדו רשמית לשני מינים נפרדים. במסגרת המחקר נמצא אכן שרוב הסמנים שנחשבו פולימורפים הראו בעצם הבדלים בין LT ו - LPT ולא בתוך האוכלוסיות של כל מין. במסגרת המחקר הצלחנו למצוא שלושה סמני SSRs פולימורפים בתוך המין LT וכמו כן פיתחנו סמן SCAR נוסף. כפי שציינו אנו נמצאים בעיצומם של הרצת הדוגמאות לקביעת גודלי התוצרים ואין הגיון בהסקת מסקנות חלקיות. עם זאת ניתן לומר שעל כל המאכסנים הנגועים ב - LT קיימים מספר האפלוטיפים של הפתוגן והאוכלוסיות אינן אחידות. שימוש בסמן הפולימורפי החדש אשר נותח על כל אוסף התבדידים )82( מראה כי אין הבדל בשכיחות האללים של הסמן על גבי אוכלוסיות שונות. ייתכן מאד והסיבה לקיום האוכלוסיות השונות יכול להיווצר מכוחות סלקציה אחרים מלבד התאמה למאכסן כגון אלימות, התאמה לטמפרטורות ועוד. אוכלוסיות ה - LPT היו בעלי שונות גנטית נמוכה מאד בסמני ה -,SSRs אפשר לשער כי זוהי אוכלוסייה מייסדת בעלת מגוון גנטי נמוך. עבור ה LPT- הראה סמן ה - SCAR שפתחנו שונות גנטית גדולה יחסית בת 4 אללים שונים. סמן זה ישמש אותנו לבדיקת תכונות פנוטיפיות המצוינות בסעיף הקודם. עבור אוכלוסיות ה - dimidiatum.n, נראה כי ריצוף בארבעת הגנים האינפורמטיביים מחלק את התבדידים למספר clades ברורים. שימוש ב MLST- אמנם יקר יותר אך מהווה שיטה אמינה וקלה לניתוח של אוכלוסיות הפתוגן. גם במקרה הזה לא זוהתה בבירור הפרדת אוכלוסיות על בסיס המאכסן. גם כאן יעשה מאמץ לנסות ולקשר בין התכונות הפנוטיפיות של אלימות והתאמת טמפרטורה לבין הרכב האוכלוסייה. 6. הבעת תודה אנו מודים למגדלים והחקלאים אשר שיתפו פעולה ותרמו להצלחת המחקר. 7. רשימת ספרות מצוטטת Alves, A., Crous, P. W., Correia, A., & Phillips, A. J. L. (2008). Morphological and molecular data reveal cryptic speciation in Lasiodiplodia theobromae. Fungal Diversity 28:1-13. Boyogueno, A., Begoude, D., et al. (2012). High gene flow and outcrossing within populations of two cryptic fungal pathogens on a native and non-native host in Cameroon. Fungal Biology 116: Carbone, I., & Kohn, L. M. (1999). A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia 91: Cardoso, J. E., & Wilkinson, M. J. (2008). Development and characterisation of microsatellite markers for the fungus Lasiodiplodia theobromae. Summa Phytopathologica 34: El-Morsi M.E. A. and Ibrahim I.A. (2012). Morphological, molecular and histopathological variation in different isolates of Botryodiplodia theobromae, the causative of leaf base rot disease of date palms in New Valley Governorate, Egypt. Wudpecker Journal of Agricultural Research 1: Slippers, B., Burgess, T., Wingfield, B. D., Crous, P. W., Coutinho, T. A., & Wingfield, M. J. (2004). Development of simple sequence repeat markers for Botryosphaeria spp. with Fusicoccum anamorphs. Molecular Ecology Notes 4:

51 פרק 6. ניספחים נספח מספר 1: בוטריוספריה באבוקדו: פרוטוקול לייצור חומר ריבוי נקי מיקי נוי הפרוטוקול נכתב בהתבסס על הידע שהצטבר לאורך המעקבים והתצפיות שבוצעו בשנה האחרונה בארץ. זהו הידע הטוב ביותר הקיים לעת הזאת. נקווה שעם התקדמות המחקר בנושא, נעמיק את הבנתנו ונשפר את המלצותינו. טיפול בעצי האם המשמשים כמקור של חומר הריבוי כל חלקות עצי האם יסקרו בתקופה בקרובה )במהלך השבועיים הקרובים(. על חלקות האם להיות נקיות מענפים יבשים. ענפים יבשים במעטפת של העץ יכולים להעיד על נוכחות הפטרייה. במידה ויש מספר קטן של ענפים יבשים, הם יסולק במידי. במידה וישנם ענפים יבשים רבים על חלק או על מרבית העצים, החלקה תיפסל ולא יאושר להוריד ממנה ענפי רכב. חשוב להדגיש שגם העצים הנמצאים בשורות הגובלות בשורה המאושרת צריכים להיות נקיים לחלוטין מענפים יבשים באופן שתואר לעיל. יש להוריד מקלות רכב אך ורק ממטע שנבחן ונמצא כמטע נקי ויזואלית. אין להוריד רכב מחלקות ועצים אשר לא נסקרו, אושרו וסומנו מאוקטבר 2013 ואילך, מופו ברמת העץ וסומנו במפה ועל גזע העץ בצבע )יש להחליט על צבע( נוהל העבודה בעצי האם לכנות ה - VC יהיה דומה. העצים יסומנו, ימופו ויירשמו המפה והרשימה החדשה תועבר לשירותים להגנה"צ. בשלב לקיחת הרכב יתועד ע"י השתלן ובעל עצי האם כל מחזור של הוצאת רכב מכל זן, על מנת לאפשר עקיבות בהמשך הגידול. עקיבות זו תאפשר את המשך המעקב בחיי השתיל והעץ. בשלב זה הוחלט לא להמליץ לרסס את עצי האם בתכשירי הדברה נגד פטריות. לאורך כל תהליך ההורדה של חומר הרכב יש להקפיד על חיטוי כל י העבודה. חומר החיטוי יהיה כלור או אקונומיקה. עצי האם המשמשים להורדת זרעים לכנות יעברו סניטציה קפדנית להורדת יובש. טיפול בחומר הריבוי לפני הרכבתו חומר הריבוי יגיע תוך 12 שעות למשתלה, תוך 18 שעות מהגעת חומר הריבוי למשתלה הוא ייטבל למשך 5-10 דקות בתכשירים קוטלי פטריות. דני, סטנלי-האם מתאים הזמן שהוא ראלי בעבודת המשתלה או שאנו יכולים לקבל תנאי הפצה? התכשירים המומלצים: קרבנדזים "בויסטין/דלסן" או "סוויץ". ריכוז התכשיר בתמיסה 0.1%. הכלים המשמשים להרכבה יעברו חיטוי ב"אקונומיקה" במעבר בין שתיל לשתיל. כל עוד השתילים במצב עשבוני מומלצת הגמעת השתילים במשתלה. החומר להגמעה יהיה "בויסטין/דלסן". כמות החומר לשתיל תהיה 5 סמ"ק בריכוז 0.1%. ההגמעה תבוצע אחת לחודשיים. לפני כל ביצוע פעולת הגמעה על פני כל המשתלה, יוגמעו 10 שתילים כניסיון ובחינה. זאת לשם זהירות ומעקב, במטרה למנוע נזק פיטוטוקסי לשתילים. מידי חודש ירוססו כל השתילים בתכשיר "קנון" בריכוז של. 0.3% יש להשתמש במצע הנבטה ו/או גידול בעל רמת ניקיון גבוהה ע"פ הנחיות השירותים להגנה"צ. לא יהיה שימוש חוזר במצע של זרע אשר לא נבט או זרע/שתיל אשר לא התפתחו כראוי או מתו. 51

52 תהיה עדיפות לשקיות שתילה/מיכלי שתילה והנבטה חד-פעמים, במידה ויש שימוש בכלים רב פעמים יש צורך לצרף נוהל חיטוי. יש צורך לצרף נוהל חיטוי החללים השונים במשתלה, הכלים השונים )ארגזים לדוגמא..(, נוהל פינוי והשמדה של פסולת צימחית, קרקע ושקיות משומשות. הוצאת שתילים לאורך כל גידול השתילים תתבצע בחינה מדוקדקת של אזור ההרכבה. לא יוצא מן המשתלה לשיווק שתיל שאזור ההרכבה שלו נראית הפרשה של אבקה לבנה, "פרסיאטול". יבוצע דיווח ל- 8 שבועות על כל מחזור לקיחת רכב מכל זן. במקרה של נגיעות ניתן יהיה לקשר לעץ/עצי האם שמהם נלקח הרכב. ישנו צורך בניהול המעקב וריכוז הנתונים משלב עצי האם-לקיחת הרכב-המשתלה-המטע. כללי יש להימנע משימוש חוזר בשקיות ובקרקע של עצים אשר התמוטטו תוך כדי תהליך הגידול במשתלה. מומלצת הקפדה על סניטציה של אזור הגידול במשתלה בכלל ושל כל כלי העבודה במשתלה בפרט. נספח מספר 2. התמודדות עם בוטריוספריה בנשירים שמעון אנטמן בשנים האחרונות אנחנו עדים להתייבשות ואף תמותה של עצי פרי גלעיניים. ההתייבשות והתמותה מלווה בהפרשת שרף רבה מאזור הגזע וענפי השלד המופיעים ללא שקיים נזק מחיפושיות קליפה ודומיהן. כאשר הענף נחתך נראים באזור החתך תסמינים של פגיעה בעיצה )אזורים פגועים בצבע שחור ובמקרים קשים גם ריקבון והתפוררות(. בבדיקות מעבדה בודדו במקרים רבים פטריות מקבוצת הבוטריוספריה. זה השלב המיני של פטריות רבות המוכרות בשמות השלב הא-מיני שלהם: דיפלודיה, הנדרסנולה, ספרופסיס, ועוד. צוות מחקר בראשותם של פרופ' דני שטיינברג ודר' דדי עזרא חוקרים את המחלה דרכי ההדבקה ואפשרויות להתגונן בפניה. עובדות שנאספו מחלקות נגועות במרבית המקרים התסמינים הופיעו על שתילים המורכבים על כנת 677. המחלה מתפרצת בעקבות עקה. עקה יכולה להיגרם מהצמאה קיצית, גיזום קיצי המחליש את העץ, יבול מוגזם, ועוד. רוב העצים הנגועים היו אפרסקים, נקטרינות, משמש ושזיפים אך המחלה נצפתה גם במינים אחרים של עצי פרי. שתילים מכל המשתלות נמצאו נגועים אך יש משתלות בהן הנגיעות הייתה רבה יותר. המחלה חודרת אל העץ דרך פצעי גיזום ו/או בזמן ההרכבה. פרוטוקול התגוננות מהמחלה הפרוטוקול נכתב בהתבסס על הידע שהצטבר בשנה האחרונה בארץ. זה הידע הטוב ביותר הקיים לעת הזו. עם התקדמות המחקר נעמיק את הבנתנו ונשפר את ההמלצות. 52

53 הנחיות לשתלנים בשלב זה אין מידע אודות עצי אם נקיים מהמחלה. בסקר שעשינו בחוות החולה נמצאו גם בבית הרשת עצים נגועים. יש לציין כי במרבית החלקות המסחריות הפגועות רכב ששימש להכנת השתילים לא נלקח מחוות החולה אלא ממקורות אחרים, לא מסומנים. לכן אנחנו ממשיכים להמליץ על חוות החולה כמקור רכב. כל רכב שנלקח )ממקור כל-שהוא( עלול להיות נגוע ולכן יש לטבלו באחד מהחומרים הבאים למשך זמן של חצי דקה. החומרים הם סקור או אנטרקול בריכוז של 0.1%, אורטיבה טופ בריכוז של 0.2%. הטבילה תעשה מיד עם הורדת הרכב מהעצים. לאורך כל תהליך הורדת הרכב יש להקפיד על חיטוי כלי העבודה בכלור או אקונומיקה. הכלים המשמשים להרכבה יעברו חיטוי במעבר בין שתיל לשתיל. כל עוד השתילים במצב עשבוני מומלצת הגמעת השתילים במשתלה בחומר בויסטין או דלסן. ריכוז החומר בתמיסה יהיה 0.1% כמות החומר לשתיל היא 5 סמ"ק לשתיל. מידי חודש ירוססו השתילים בתכשיר קנון או דומיו בריכוז 0.3%. לא יהיה שימוש חוזר בכנה בה ההרכבה לא הצליחה מחשש שהתמותה נגרמה מהמחלה והכנה נגועה. כמו כן לא יהיה שימוש חוזר במצע גידול. לאורך כל תקופת הגידול תעשה בחינה מדוקדקת של אזור ההרכבה. שתיל עם שרף באזור ההרכבה יפסל לשיווק. הנחיות לנוטעים יש לוודא שהשתילים שקנית עברו את התהליך שתואר בסעיף הקודם. כיוון שחדירת המחלה חלה דרך פצעים הרי שיש להקפיד הקפדה יתרה על זמן הגיזום ואיכותו. משנה שלמדנו ושכחנו נוגעת לטיב החתך שאנו עושים. יש המון חתכים בצורת "שולחן" שלעולם לא יגלידו ויהוו מקום הדבקה מצויין. שכחנו שחתכים מגודל צול ומעלה יש למרוח בחומר חיטוי. צריך לחזור לגירסא דינקותה לחתוך נכון ולמרוח החתך. אנחנו עדים לכך שבזמן עקה לעץ, יש התפרצות של הפטריה. עקה תגרם מהצמאה ממושכת, גיזום קיצי המחליש את העץ, חיגור, וכולי. יש להימנע מכל אלה במטעים נגועים אין לעבור מעץ אחד למשנהו ללא חיטוי כלי הגיזום. 53

54 נספח מספר 3. פרוטוקול לטיפול במטעי אבוקדו המשמשים כמקור לחומר ריבוי 54

55 55 מיזם חוס"ן בוטריוספריה. דו"ח לשנת המחקר השנייה

56 נספח מספר 4. נימוקי הוועדה שבחרה את עוזרי המחקר של המחלקה לפתולוגיה וחקר העשבים כצוות מצטיין של משרד החקלאות ופיתוח הכפר לשנת

57 57 מיזם חוס"ן בוטריוספריה. דו"ח לשנת המחקר השנייה